秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染及UL54、UL97基因突变关系.doc

秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染及UL54、UL97基因突变关系 　 作者：盛秋，李芬，于学文，李琦，韩蓁，李学成，任永惠 【摘要】 目的 探讨秦巴山区孕妇妊娠期人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与HCMV UL54、UL97基因突变的关系。方法 采用PCR方法检测228对孕妇血清和新生儿脐血血清中的HCMV DNA，对HCMV DNA阳性者采用限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法检测HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子是否发生突变。结果 ①228例孕妇血清中HCMV DNA阳性者19例，阳性率为8.33%；新生儿脐血血清中HCMV DNA阳性8例，阳性率为3.51%。在19例HCMV DNA阳性孕妇中，其配对脐血阳性7例，HCMV宫内传播率为36.84%。②HCMV DNA阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中均未发现HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子发生突变。结论 秦巴山区HCMV宫内感染的发生率较高，其发生与HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子突变无相关性，但不排除存在其他位点突变或其他形式基因异常导致病毒致病性改变的可能性。 【关键词】 人巨细胞病毒；HCMV宫内感染；基因突变 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是人类先天性感染的常见原因之一，在人群中感染广泛。孕妇感染HCMV后可导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓、新生儿先天畸形、新生儿并发症及远期后遗症等。本课题既往对秦巴山区的研究调查表明，该地区孕妇孕期HCMV感染率为19.59%，明显高于国内外文献的报道[1]。目前对HCMV导致胎儿损害的机制尚不能做出完善的解释。近年来，从分子水平研究HCMV的发病机制是倍受关注的热点。本研究在国内首次采用分子生物学的方法探讨秦巴山区孕妇妊娠期宫内HCMV感染与基因突变的关系，以期揭示其发病机理，采取有效的防治措施，最终达到提高出生人口素质的目的。 　　1 资料与方法 　　1.1 研究对象 　　选取2002年5月至2005年7月秦巴山区2县4乡住院分娩的单胎孕妇228 例作为研究对象。孕妇年龄20-36(25.83±2.23)岁，孕周35-41周，其中自然分娩189例，剖宫产39例(均为产科因素)。分娩时成对采集孕妇肘静脉血及新生儿脐带血(脐血在胎儿娩出后未断脐时于脐带胎儿端抽取)，每份样本5mL，分离血清后于-70℃保存。所有孕妇均无妊娠合并症，无风疹病毒、弓形虫及单纯疱疹病毒活动性感染，且排除家族性遗传性疾病。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因片段的PCR扩增 　　盐析法提取HCMVDNA。UL54基因的扩增及检测：所用引物为5χCGCCACCAAGGTGTATAT 3χ和5χAGTGG TTGGGCAGGATAA 3χ，反应体系为25μL。体系中含有10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP混合液0.5μL，MgCl2(25mmol/L)1.5μL，引物混合液0.5μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶(u/μL)1μL，无菌去离子水17μL，无菌液体石蜡20μL。循环条件为：94.5℃ 50s，55℃ 45s，72℃ 50s，共35个循环，最后72℃ 7min。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。UL97的扩增及检测：所用引物为 5χCGGTCTGGACGAGGTGCGCAT3χ和5χ AA TGAGCAGACAGGCGTCGAAGCAGTGCGTGAG CTTGAAGTTCTT 3χ。反应体系同上。循环条件为：94.5℃ 1min，51℃ 45s，72℃ 50s，共40个循环，最后72℃ 7min。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 　　1.2.2 PCRRFLP检测基因突变 　　 ①UL54基因501密码子的检测：扩增后的UL54片断用限制性内切酶AluⅠ在37℃水浴箱2h进行酶切，3g/L琼脂糖凝胶检测酶切结果。②UL97基因594、594密码子的检测：扩增后的UL97片断分别用限制性内切酶HhaⅠ在37℃水浴箱2h进行酶切及TaqⅠ在65℃水浴2h进行酶切，酶切产物用100g/L聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。 　　1.3 统计学处理 　　采用SPSS11.0软件对数据进行处理，计数资料采用Fisher精确概率法进行统计学检验，显著性标准为α=0.05。 　　2 结 果 　　2.1 孕妇HCMV宫内感染情况 　　228例配对血中，孕妇血清HCMV DNA(＋)19例，阳性率为8.33%；新生儿脐血血清HCMV DNA(＋)8例，阳性率为3.51%。在19例HCMV DNA(＋)孕妇中,其配对脐血阳性7 例， HCMV宫内传播率为36.84%；209例HCMV DNA(-)的孕