类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及相关基因Fas表达探究.doc

类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及相关基因Fas表达探究 　［摘 要］ 目的：研究类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)患者滑膜组织中细胞凋亡及相关基因蛋白Fas的表达和意义。方法：采用免疫组织化学方法，对9例患者及8例正常对照滑膜组织中凋亡细胞及Fas的表达进行检测。结果：RA患者滑膜组织中细胞凋亡率明显低于对照组，而Fas阳性的细胞百分比却明显高于对照组。结论：RA患者滑膜组织中细胞凋亡的减少可能是导致滑膜过度增生进而关节功能丧失的原因之一，Fas表达虽增多但不能直接诱导细胞凋亡。　　［关键词］ 类风湿关节炎；细胞凋亡；免疫组织化学 　　类风湿关节炎(RA)是一常见的以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的全身性疾病，我国成人中发病率约为0.3%。RA的主要病理特征是关节滑膜的增生和软骨及骨组织的侵袭破坏，有很高的致残率，其发病机制目前尚不十分清楚。近年的研究表明，细胞凋亡是其发病中的一个重要机制［1～3］。我们采用TUNEL法和免疫组化法对甲醛固定及石蜡包埋的RA患者及对照的滑膜组织进行细胞凋亡及其相关基因Fas表达的研究，旨在探讨RA滑膜增生的机制及凋亡相关基因Fas介导的细胞凋亡在RA发病中的作用。 　　1 资料与方法 　　1.1 临床资料 在西安市第五医院住院手术治疗RA患者9例，均符合美国风湿病学会1987年的RA诊断标准，其中男性2例，女性7例，年龄16岁~67岁，平均年龄(32.8±15.0)岁，病程1 a~23 a，平均病程(12.8±7.7) a。所有患者均有不同程度的关节活动性病变(有3个或3个以上关节持续性肿胀)，平均受累关节数为18个,6例类风湿因子(RF)阳性,3例阴性,血沉16 mm/h~83 mm/h，平均(55.0±23.6) mm/h，其中关节功能分级：Ⅰ级2例，Ⅱ级1例，Ⅲ级5例，Ⅳ级1例。关节X线表现分期：Ⅱ期2例，Ⅲ期1例，Ⅳ期6例。患者滑膜组织均取自滑膜切除术中的膝关节和/或腕关节，8例正常对照的滑膜组织取自骨折或外伤截肢者的膝关节。 　　1.2 组织处理 切取0.5 cm～1 cm滑膜组织,4%多聚甲醛固定,3%EDTA脱钙,石蜡包埋，用10%的多聚赖氨酸处理载玻片,滑膜组织切片为6 μm,室温贮藏备用。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡，3%H2O2处理样品切片10 min后,用蛋白酶K(ProteinaseK)于37 ℃消化5 min;取TdT和DIGdUTP各1 μl,加入18 μl标记缓冲液于滑膜组织片37 ℃杂交2 h;封闭液孵育30 min,生物素化抗地高辛抗体反应30 min;SABC稀释液反应30 min,DAB显色,苏木素轻度复染。阳性对照采用乳腺癌石腊切片,阴性对照采用PBS替代第一抗体。 　　1.3.2 Fas单克隆抗体免疫组化 滑膜切片二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,0.3%H2O2的甲醇液冲洗,磷酸盐缓冲液冲洗,加入1%牛血清白蛋白,20 ℃孵育15 min。第一抗体用鼠抗人Fas多克隆抗体在4 ℃下孵育16 h，第二抗体(碱性磷酸酶生物素标记的抗鼠IgG)孵育20 min，用3hydroxy2naphthylocid2,4dimethylaniline进行呈色反应。细胞核用苏木素染色。 　　1.3.3 结果判定 TUNEL法染色胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。Fas标记阳性物质主要定位于细胞的胞质，阳性结果为红色颗粒，并在光学显微镜10×10倍视野下,在每个样本关节滑膜组织中随机选取2个～4个视野,分别计100个细胞内平均凋亡阳性细胞数和Fas阳性细胞数, 　　1.3.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计学软件做统计学分析，实验数据用±s进行RA组与对照组间t检验，检测标准取双侧α=0.05。 　　2 结果 　　2.1 TUNEL法细胞凋亡在滑膜组织中的表达 RA组与对照组均可见细胞凋亡,但RA患者滑膜衬里层中细胞凋亡率明显低于对照组，两组相比差异具有显著性(Plt;0.05)。 　　　2.2 Fas蛋白在RA患者滑膜组织中的表达 RA组与正常对照组均可见Fas的阳性表达,但RA患者滑膜衬里层中Fas阳性的细胞百分比明显高于对照组，两组相比差异具有显著性(Plt;0.05)，见表1。 　　表1 凋亡细胞及Fas在滑膜衬里层细胞中的阳性表达计数结果（略） 　　注:与对照组比较*Plt;0.05 　　3 讨论 　　RA的病理特征主要表现为滑膜细胞(主要是成纤维细胞)的增殖与炎性细胞的浸润，导致滑膜增厚、骨与软骨组织的受损，最后导致关节的破坏。目前对滑膜增生的确切原因还不清楚，但这些细胞的积累肯定部分与细胞凋亡抵抗或缺陷有关［1］。本