结缔组织生长因子特异性结合肽表达及分离纯化.docVIP

结缔组织生长因子特异性结合肽表达及分离纯化 　【摘要】 目的：利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子（CTGF）特异性结合的小肽。方法：设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段，插入pET32(a)+质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游，构建重组质粒，转入E.coli BL21表达菌中，用终浓度1mmol·L-1的IPTG诱导表达融合蛋白；用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化，然后用亲和层析进一步纯化，经肠激酶切割，最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽；用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果：所构建的重组质粒测序结果与预期一致；诱导表达后用SDSPAGE鉴定，发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现，与预期一致；融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化，得率分别为78.6％和52.3％；用亲和层析纯化得率为50.5％；经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽，用反相色谱鉴定其纯度大于95%；最终每升发酵液获得3.4mg目的肽。结论：成功制备CTGF特异性结合肽，为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。 【关键词】 结缔组织生长因子 分离纯化 特异性肽 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是Bradham等[1]于1991年首次在人的脐静脉内皮细胞培养基中发现的细胞因子，由349个氨基酸残基构成；主要由皮肤成纤维细胞[2]、肾小球系膜细胞[3]、肝星状细胞[4]、肺成纤维细胞[5]、血管平滑肌细胞[6]等合成分泌。CTGF可以促进细胞增殖、合成胶原，介导细胞黏附[78]，诱导细胞凋亡[911]，促进血管形成[12]，刺激成纤维细胞生长，并参与调节细胞分化、胚胎发育以及伤口愈合，在多种器官和组织纤维化的发生、发展过程中起重要作用。本研究在先前我们用噬菌体展示技术发现CTGF特异性结合肽的基础上[13]，利用基因工程技术制备该小肽，为进一步研究其生物学活性，开发成CTGF小分子抑制剂打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 BL21（DE3）[HsdS gal(λcIts857 indI Sam7 nin5 lacUV5T7I)]、JM109，本实验室保存； pET32(a)+质粒、肠激酶试剂盒，Novagen公司；HisSelectTM，Sigma公司；SephadexG25, Phamarcia公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ，T4 DNA连接酶，Promega公司；胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；水平摇床，太仓市光明实验分析仪器厂。 1.2 方法 1.2.1 目的基因的合成 根据我们先前从随机12肽库中筛选得到的噬菌体阳性克隆DNA测序结果，合成一对带有肠激酶位点、编码目的基因（810A）的相互配对的引物Pa1和Pa2，用ddH2O配成50pmol·μl-1的引物溶液。PCR反应体系如下：dNTP（10mmol·L-1）0.5μl，10×buffer 2.5μl， Pa1和Pa2各1μl，Taq酶（10U·μl-1）0.2μl，最后ddH2O补齐至25μl；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 变性30s，60℃ 退火30s，72℃延伸 30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保温。PCR产物用20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，EB染色5min，紫外灯下观察并切下目的条带，用凝胶回收试剂盒纯化目的片段。 1.2.2 表达载体的构建 将含pET32(a)+质粒的大肠杆菌接种于含氨苄青霉素 (终浓度100μg·ml-1 )的 MHAmp平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落，接种于含相同质量终浓度氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇至A600 nm为0.6，提取pET32(a)+质粒DNA，12g·L-1琼脂糖凝胶电泳观察结果。用限制性内切酶BamHⅠ及XhoⅠ，37℃酶切pET32(a)+质粒DNA和PCR产物2h，65℃ 20min灭活。12 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，EB染色，紫外灯下观察并切下目的条带，用凝胶回收试剂盒进行凝胶回收。在EP管中依次加入回收的质粒DNA10μl，目的基因片段1μl，10×连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，4℃连接过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热激90s，加入预热的LB培养液1ml，37℃水浴30min，离心将沉淀涂布于含氨苄青霉素(终浓度100μg·ml-1) MHAmp平板上，37℃培养过夜。随机挑选单菌落接种于含氨苄青霉素(终浓度100 μg·ml-1)的LB液体培养液，37℃震摇6h，抽提质粒，分别用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和E