肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白及Toll样受体4表达.docVIP

肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白及Toll样受体4表达 　【摘要】 目的: 探讨肾组织葡萄糖调节蛋白78、 94（GRP78、 94）和Toll样受体4（TLR4）的表达及其在肝肾综合征发生中的作用。方法: 采用胆总管结扎诱导肝硬化及肝肾综合征大鼠模型（BDL组）, 术后1、 2、 4和6周各选6只大鼠取血及组织标本。从股静脉取血, 监测血浆丙氨酸转氨酶（ALT）、 总胆红素（TBil）、 尿素氮（BUN）、 肌酐（Cr）。用ELISA检测血浆肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。取肝、 肾组织称其质量, 并制备标本; 用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、 蛋白质Western blot分别检测肾组织GRP78、 94和TLR4 的mRNA 及蛋白表达。同时以假手术组设为对照（C组）。 结果: 与C组比较, BDL组各时间点大鼠肝脏、 肾脏质量及血浆ALT、 TBil和血浆TNFα均明显升高（Plt;0.05）, 4周和6周BUN和Cr也明显升高（Plt;0.05）。BDL组各时间点肾组织GRP78、94 mRNA 及其蛋白表达均明显低于C组（Plt;0.01）, 而TLR4 mRNA 及其蛋白表达量却明显高于C组（Plt;0.01）。结论: 肾组织GRP78、 94表达减少可能有助于TLR4炎性信号通路激活, 并可能与肝硬化并发的肝肾综合征发生相关。 【关键词】 肝肾综合征 葡萄糖调节蛋白 Toll样受体4 　　肝肾综合征是肝硬化失代偿期的常见并发症, 炎性损伤是其发生的主要机制之一［1］。近来研究认为, 内质网应激蛋白不仅是分子伴侣, 而且可作为内源性“危险分子”被Toll样受体（Tolllike receptor, TLR）识别, 而参与炎性应答［2］。本研究中, 我们从TLR4表达变化来探讨内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白（glucoseregulated protein, GRP）78、 94在肝肾综合征中的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　SD大鼠雌雄不限(体质量220～250 g, 给予标准饮食、 22℃～24℃、 12 h白天/黑夜循环、 湿度55％～60％的动物房饲养), 购于浙江大学医学实验动物中心。TRIzol购于Invitrogen公司; RTPCR试剂盒购于Promega公司; TritonX100蛋白裂解液购于Sigma公司; 山羊抗大鼠GRP78/94、 TLR4、 三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）单克隆抗体（mAb）及过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG 抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司; 大鼠TNFα试剂盒购于深圳晶美公司。其余试剂均购于上海生工公司。βactin、 GRP78/94、 TLR4 mRNA引物由上 海生工公司合成。 　　1．2 方法 　　1.2.1 引物设计 　　TLR4引物（600 bp, NM019178）: 上游5′CCA AGA ACC TAG ATC TGA GC3′; 下游5′GGA CAT GTA AAC CAG TCA TG3′。 GRP78引物（489 bp, U16277）: 上游5′GGC GGA TCG TGC CTC TCA TT3′; 下游5′GAC CAG TCG CTC AGC AGT CA3′。GRP94引物（460 bp, BC011439）: 上游5′CCA TGG CTT ATA TCC ACT TC3′; 下游5′GTA ATG TCA GTT GAA TGG TG3′。βactin引物（270 bp, NM031144）: 上游5′GTA GCC ATC CAG GCT GTG TT3′; 下游5′GAA GTC TAG GGC AAC ATA GC3′。 　　1.2.2 大鼠肝肾综合征模型构建 　　SD大鼠饲养1周后, 随机分为2组。实验组（BDL组）用胆总管结扎法诱导肝硬化［1］: 戊巴比妥腹腔麻醉SD 大鼠, 开腹暴露胆总管, 用丝线在胆总管远、 近端结扎, 于两结扎中间剪断胆总管, 关腹。假手术组（Sham组）仅开腹, 暴露胆总管但不剪断, 再关腹。两组分别在术后1、 2、 4、 6周各取6只大鼠称体质量, 股静脉采血测血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、 总胆红素（TBI）、 尿素 氮（BUN）、 肌酐（CRE）及TNFα含量; 然后用戊巴比妥腹腔麻醉后处死取肝、 肾并称体质量。200 mg肾组织置于-70℃液氮保存备用; 肝、 肾组织各500 mg以100 g/L甲醛固定, 石蜡包埋、 切片, 苏木素伊红（HE）染色。由两位病理医师双盲评价肝、 肾组织病理。 　　1