胡桃醌对人肝癌BEL7402细胞增殖及膜流动性影响.docVIP

胡桃醌对人肝癌BEL7402细胞增殖及膜流动性影响 　 作者：陈丽 那顺巴雅尔 张建 于娟 顾为望 【摘要】 目的：研究胡桃醌诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡及其作用机制。方法：采用MTT法测定细胞生长抑制率，通过流式细胞仪观察凋亡细胞，采用荧光偏振技术离体动态地检测30 min内胡桃醌对BEL7402细胞各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η的影响，分析细胞膜流动性的改变。结果：各浓度的胡桃醌均可抑制人肝癌BEL7402细胞的生长，诱导其凋亡，IC50为13.78μM。不同浓度胡桃醌均可引起BEL7402细胞膜的r、P和η值显著性降低（Plt;0.05），尤其在前1 min内r、P、η值下降迅速，1min后各指标下降的趋势渐渐平缓。结论：胡桃醌能显著增加BEL7402细胞的膜流动性，促进其本身进入细胞内部，抑制细胞的增殖，诱导细胞凋亡。 【关键词】 胡桃醌； BEL7402； 细胞凋亡； 膜流动性 胡桃醌（Juglone），又名5羟基1，4萘醌，分子式C10H6O3。存在于胡桃科植物胡桃及其同属植物黑核桃的未成熟的外果皮(青皮)、树枝和树皮中，是其主要的毒性物质 ［1，2］。胡桃醌为棕红色结晶，其熔点155℃，微溶于水，遇碱呈紫红色,有升华性，其化学结构清楚（图1）。国外曾有研究者对胡桃醌的抗肿瘤活性做过部分研究，但未见用于临床［3～5］。民间胡桃皮作为抗癌验方，渊源流长，作为胡桃青皮的主要成分胡桃醌的抗癌活性国内亦有报道。研究表明胡桃醌还有抗真菌、抗衣原体或HIV病毒、降血糖和杀虫等生物活性，越来越受到人们的重视［6～9］。胡桃醌可以直接抑制体外培养肿瘤细胞的增殖，其作用与药物浓度和作用时间有依赖关系，有希望成为新的化疗药物。但目前关于胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡的细胞信号调控机制尚不明确,已有报道的结论不甚一致。另外，由于细胞膜不仅与细胞的生长调控过程、免疫反应和信息传递等基本功能密切相关，而细胞表面成分的改变又与肿瘤细胞的侵袭、转移能力密切相关因此，本研究采用人肝癌BEL7402细胞系为模型，在考察胡桃醌对BEL7402细胞增殖影响的基础上，在诱导细胞分化的过程中观察胡桃醌对肿瘤细胞膜的影响，探讨其抗肿瘤作用的机制。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 胡桃醌：购自sigma，Lot：07605DH。精密称取3.5mg胡桃醌，溶于100μLDMSO中，再用PBS稀释成终浓度为20mM的胡桃醌母液，-20℃保存备用。新生牛血清（FBS）：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lot：TBD41HX。使用前置于56℃水浴中灭活30min，-20℃保存备用。青霉素/链霉素液：购自TBD，LotRPMI 1640培养基：购自海克隆生物化学制品有限公司，Lot：NSG0058，使用前每500ml培养基分别加入10%的FBS，5.5ml青霉素/链霉素液，配制成完全培养基，4℃保存。胰蛋白酶/EDTA消化液：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lot：TE2004Y。二甲基亚砜（DMSO）：购自sigma，Lot：D5879，常温避光保存。1，6二苯基1，3，5己三烯(DPH)购自sigma公司，Lot：076K3674。Flou3/AM购自Biotium，InC，Lot：6F0221。其余试剂为国产分析纯。MTT：购自Sigma，Lot：M2128，用PBS配成5mg/ml工作液，44℃避光保存。 YG875B超净工作台，上海医疗器械厂。CO2细胞培养箱为Thermo公司，多光谱微孔板阅读器Version 5为美国Mecular Devices Corporation公司，FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司。 1.2 细胞培养与处理 论文代写 BEL7402细胞，广东药学院寄生虫教研室惠赠。细胞置于RPMI 1640完全培养基中，在37℃、体积分数为5% CO2，95％湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，每3天更换1次培养基，细胞每周按1：3传代。 1.3 胡桃醌对BEL7402细胞株生长的影响 取对数生长期的BEL7402细胞株，用含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为1×105/mL细胞，体积为 200μL，铺96孔培养板，复孔8孔，体外培养24h 后更换为含系列浓度的胡桃醌培养液（终浓度分别为100、50、25、12.5及6.25μM），设立正常对照组和溶剂对照组（1‰DMSO），体外培养48 h后以 MTT法测定OD值，实验重复3次，依下列公式 计算 胡桃醌对BEL7402细胞株的抑制率： 论文代写 抑制率