脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列探究-.docVIP

脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列探究* 　李斌元，马 云，何淑雅，钟 南，孙春莉，闵凌峰 关键词： 脆性X综合征 【摘要】 目的 检测脆性X染色体综合征智力低下基因FMR1中（CGG）n拷贝数的多态性。方法 采用PCR结合序列胶银染法、Southern blot杂交分析法，对299条表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n拷贝数的多态性及分布频率进行了测定和验证。结果 显示其范围为20～40，高峰为28 ，PCR-序列分析银染法结果与Southern blot法结果完全一致。结论 检测了湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n拷贝数的多态性；运用PCR-序列分析胶银染法快速、直接、简便、实用，适合脆性X综合征的大规模群体筛查。 【关键词】 脆性X综合征 FMR1 （CGG）n PCR The study of the unsteady DNA repeat located in the mentally retardant FMR1 gene of fragile X 【Abstract】 Objective To detect the polymorphism of CGG repeats located in the mentally retardant FMR1 gene of fragile X.Methods To detect and test the polymorphism and frequency of CGG repeats located in the FRAXA region come from 299 chromosome of normal hunan pupulations.Results The normal range of CGG repeats is 20-40，the mean number is 28， the data showed that the results of PCR-sequence gel silver staining was the same as those of PCR-Southern blot. Conclusion Realize the polymorphism of CGG repeats located in the FRAXA locus;2. The PCR-Sequence gel silver staining was more rapid，immediate， simple and economy ，which suits to the colony screening fragile X syndrome on a large scale. 【Key words】 fragile X syndrome FMR1 CGG repeats PCR 脆性X综合征（fragile X syndrome，FraX）是常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率仅次于唐氏综合征。在人群中男性的发病率约为1/4000［1］，女性的发病率为1/2500［2］。其在细胞学上主要表现为Xq27.3带处有一细丝样的脆性位点（FRAXA）［3］，在分子水平上表现为FMR1基因5端（CGG）n的异常扩增。（CGG）n在正常人群体中呈多态性，n=6-50，当n=50-200时为前突变，n＞200时为全突变，同时伴随其周围CpG岛异常甲基化［4］。我们根据FraX基因致病特点，通过测定湖南省人群中CGG重复序列，了解其分布的多态性，并建立一个简便、快捷的基因检测方法。 1 材料和方法 1.1 研究对象及标本 208名人群为本校附属医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均36.5岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。 1.2 主要试剂 T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针PE5.1由美国纽约州立发育不全基础研究所Nanbert Zhong博士惠赠。 1.3 PCR扩增 PCR引物设计参照文献［5］，在FMR1基因内（CGG）n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为：5-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3’，下游引物为：5-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG -3’。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1U Taq DNA聚合酶。反应程序为：95℃预变性5min，95℃1mi