脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱建立及分析.docVIP

脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱建立及分析 　【摘要】 建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱，观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法:采用反复冻融法抽提血清蛋白质，以优化的双向电泳技术分离血清蛋白质，建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱，并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果:通过双向电泳，建立血清蛋白质双向电泳图谱，选取具有明显差异的蛋白点21个进行质谱鉴定，共鉴定出8种蛋白质。结论:通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白表达图谱及质谱分析，可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。 【关键词】 重症肌无力; 蛋白质组; 电泳; 乙酰胆碱受体 　　重症肌无力（myasthenia gravis， MG）主要是由乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor， AchR）抗体介导的，补体参与，细胞免疫依赖性，针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病。对于MG的治疗至今仍缺乏有效手段。蛋白质组技术利用其核心技术双向电泳（two-dimen-sional gel electrophoresis， 2-DE）对组织或细胞总蛋白质进行分离［1］，并通过正常与疾病组织的差异表达蛋白比较，找到与该疾病相关的蛋白质分子。本研究通过建立脾肾虚型重症肌无力患者和正常人血清总蛋白质的双向电泳图谱，寻找有明显差异性表达的蛋白，对差异表达的蛋白进行鉴定和研究，为进一步研究MG发病机制以及MG诊断治疗提供实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 血清采集 MG患者全血来自2004～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷冻保存备用。 　　1.2 主要试剂 固相pH梯度干胶条IPG strip（Amersham公司产品， 非线性pH 3～10， 7 cm）。3-［3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐｛3-［（3-cholamidopropyl） dimethylamino］-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N， N’-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），过硫酰胺（am-monium persulfate， APS），三羟甲基氨基甲烷［tris （hydroxymethyl） aminomethane］、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。 　　1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司产品;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQ Deca XP Plus，美国Thermo Finnigan公司产品。 　　1.4 双向电泳 　　1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量 血清-70 ℃反复冻融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column处理去除高丰度蛋白。使用Agilent 5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。 　　1.4.2 等电聚焦 自-20 ℃取出的胶条，室温下平衡10 min，以500 μg上样量在每份