自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代内耳功能及形态学探究.docVIP

自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代内耳功能及形态学探究 　［摘要］目的: 观察自身免疫性感音神经性聋（ASNHL）雌性豚鼠子代内耳听觉生理功能及组织结构病理变化，探讨内耳自身免疫因素与子代内耳听觉损伤的相关性。 方法: 采用同种粗制内耳抗原（CIEAgs）免疫，造成雌性豚鼠ASNHL，妊娠后持续抗原强化免疫，对其所产子鼠进行相关指标测试和观察，包括听神经复合动作电位阈值、幅值和耳蜗微音器电位伪阈，血清抗CIEAgs抗体水平以及内耳病理形态学观察。 结果: ASNHL雌鼠的子代36只中有18只（22耳）出现听力损伤，血清抗CIEAgs抗体增高，螺旋神经节细胞变性，数目减少，蜗螺旋管内炎性细胞浸润。 结论: ASNHL所产子鼠可出现先天性感音神经性聋和内耳病理损伤，其发生可能与特异性体液免疫有关。 　　［关键词］ 先天性感音神经性聋;自身免疫;内耳功能;豚鼠 　　我国新生儿的先天性聋发生率为1.1000～6.1000，其中以先天性感音神经性聋（congenital sensori-neural hearing loss，CSNHL）居多。非遗传性CSNHL的病因主要有妊娠期病原微生物感染、使用耳毒性药物、高危妊娠等［1］ ，但仍有许多CSNHL原因不明。本项目组前期实验研究发现，实验性自身免疫性感音神经性聋（autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL）豚鼠的子代中部分出现先天性聋［2］ 。本研究旨在通过观察自身免疫性感音神经性聋雌性豚鼠所产子代内耳听觉功能及组织结构病理变化，进一步探讨自身免疫因素导致先天性聋的作用及其机制。 　　 1 对象和方法 　　1.1 动物健康白化豚鼠70只，由南京医科大学医学实验动物中心提供，雌性50只，雄性20只，体重400～450g，耳郭反射阳性，耳镜检查排除中耳疾患。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 实验设计 将雌鼠随机分为两组，第1组40只，首次免疫每只按0.4mg#12539;（0.4ml）-1 粗制内耳抗原（crude inner ear antigens，CIEAgs）与等量完全弗氏佐剂乳化后于豚鼠右后足垫和背部多点皮下注射，以后每 隔2周，采用CIEAgs0.4mg#12539;（0.4ml）-1 与等量不完全弗氏佐剂乳化后按上述方法强化免疫;第2组10只，用0.1mol#12539;L-1 pH7.4的PBS代替CIEAgs，免疫方法同第1组。免疫3次后进行听力测试，并以第2组听神经复合动作电位（cAP）N1 波阈值、幅值和各频率耳蜗微音器电位（CM）伪阈的均数加两倍标准差作为听力损伤的标准，任一指标异常判定为听力损伤，从而确定第1组中产生的ASNHL模型动物共14只，交配妊娠后持续强化免疫，其子代36只作为实验组，第2组雌鼠的子代18只作为对照组。 　　 1.2.2 CIEAgs制备 活体断头，显微分离并取出豚鼠膜迷路（包括基底膜、螺旋韧带、半规管、椭圆囊和球囊），经超声粉碎、匀浆、离心（1500r#12539;min -1 ，5min），取上清液，在紫外分光光度计下分别测280、260nm的吸光度（A值），计算其蛋白含量，分装后低温干燥，制成干粉备用。 　　1.2.3 耳蜗电图检测 母鼠第3次免疫后2周、子鼠出生后2～3周进行。采用面神经管电极和Amplaid k12听觉诱发电位测试系统，刺激声信号为Click，重复频率为11次#12539;s-1 ，记录cAP N1 波阈值、幅值;采用0.5、2、8kHz短纯音作为刺激声信号，记录CM伪阈。 　　1.2.4 血清抗CIEAgs抗体检测 子鼠听觉电生理检测后取血清，采用酶联免疫吸附试验间接法进行检测。包被抗原为CIEAgs，一抗为1∶10稀释的豚鼠血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，显色底物为邻苯二胺.过氧化氢溶液，检测波长为490nm的吸光度A值。 　　1.2.5 颞骨火棉胶切片观察 子鼠取血清后断头，取出听泡，经固定、脱钙、脱水、浸胶、包埋等制成火棉胶块，水平切片厚度为15μm。每一耳蜗取靠近蜗轴的3张切片，HE染色后光镜观察。螺旋神经节细胞计数按文献［3］方法，目镜加网格片，每小格在10×40放大倍数下覆盖10μm×10μm面积，只计算底回数目。 　　 1.3 统计学方法 计量资料以ˉx±s表示，统计学处理均采用t检验，以Plt;0.05判断为差异有显著性意义。 　　 2 结 果 　　2.1 内耳听觉功能实验组与对照组相比，cAP N1 波阈值提高，幅值减小，各频率CM伪阈提高，差异均有显著性（Plt;0.01）。见表1、2。表1 子代豚鼠cAP N（略）表2 子代豚鼠各频率CM（略） 　　2.2 血清抗CIEAgs抗体水平对照组血清抗体A值为0.1628±0.0357，