葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体制备及其在筛选致敏蛋白组分应用.docVIP

葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体制备及其在筛选致敏蛋白组分应用 　 作者：李雅莉，孙秀珍，高燕华，刘昀，张洁，冯向莉 【摘要】 目的 制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体，并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选。方法 用葎草花粉变应原浸液免疫兔，获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清，应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果 兔抗血清效价经ELISA检测，效价gt;1∶10000，免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线，Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分，分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38ku，患者血清IgG可以识别5种蛋白组分，分子质量分别为100、76、55、49、38ku。结论 制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性，应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似，因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。 【关键词】 李雅莉，孙秀珍，高燕华，刘昀，张洁，冯向莉 在我国，葎草是仅次于蒿属的重要的夏秋季致敏花粉，受累人口众多。葎草花粉飘散的高峰时间较长，诱发的症状较重，患者常常要求进行特异性免疫治疗(specific immunotherapy, SIT)，并希望能长期治疗。目前临床上使用的葎草花粉变应原浸液质量难以标准化，在诊断和治疗方面存在很多不足之处，而基因工程生产的重组变应原则能够克服天然变应原浸液的局限性。国内外研究证实采用构建cDNA文库、分离单一过敏原蛋白及氨基酸序列分析相结合的方法，是研究过敏原基因的首选方法。选择高效价的抗体作为筛选cDNA文库探针，是进行诊断和治疗用重组变应原疫苗的前提。目前国内对于寄生虫cDNA文库的筛选多选用免疫动物血清[13]，而对于引起变态反应性疾病的过敏原基因阳性克隆筛选多用患者血清[4]，未见有应用动物多克隆抗体和人抗血清同时筛选文库的报道。在已构建葎草花粉cDNA文库基础上，如何快速地筛选特异的致敏蛋白组分成为研究致敏原基因的关键。本文旨在比较兔抗葎草花粉多克隆抗体与人抗葎草花粉血清特异性识别抗原结果，筛选出葎草花粉致敏蛋白组分的快速而特异的方法，为重组葎草花粉变应原的生产和临床应用奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，山羊抗人IgG(北京鼎国进口分装)，标准蛋白(Sigma公司)，PVDF膜(北京鼎国进口分装)。 　　5415D型高速离心机(德国eppendorf公司)，852型恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)，Vcx 500型超声细胞粉碎仪(Sonics amp;MATERIALS)，全自动凝胶成像分析系统(美国BioRad公司 Gel Doc 2000)，POLARstar酶标仪(德国BMG 公司)，ＣＡＰ变应原体外检测系统(瑞典Pharmacia公司)，微型垂直电泳仪、转印仪(美国BioRad公司)，UV3000紫外/可见分光光度计(日本岛津公司)。实验动物：健康雄性白兔2只，体重1.92.0kg，购自西安交通大学医学院实验动物中心。 　　1.2 血清收集 　　阳性患者血清：临床上选择对葎草花粉变应原点刺试验(SPT)≥的过敏性哮喘患者10例，其中男5例，女5例，取静脉血3mL。分离血清后，用法玛西亚CAP变应原自动检测系统，收集对葎草花粉变应原特异性反应阳性达2级或2级以上患者血清，分装后-70℃保存。阴性对照血清：4例无变态反应史健康人，各种变应原点刺试验阴性，取静脉血3mL，分离血清后，-70℃保存。 　　1.3 葎草花粉变应原浸液的制备 　　自然脱落法收集葎草花粉，9号分样筛过筛，室温下乙醚脱脂。取脱脂花粉5g加Cocas液100mL，超声粉碎(约150W，超声时间5s，间隔5s，工作次数30次)后4℃下搅拌提取72h，4℃下13000×g离心30min，取上清。上清液以去离子水透析24h，自然蒸发浓缩。除菌滤过后经灭菌检查显示花粉粗制提取液灭菌完全，无细菌生长，可以免疫使用。并经考马斯亮蓝结合法测定致敏蛋白，样品终质量浓度为5.4g/L。 　　1.4 兔抗血清制备 　　选2只3月龄、体重1.9-2.0kg的健康雄性家兔。免疫前3d，于兔耳缘静脉采血留作阴性对照。将一定量的葎草花粉粗制浸液同等量的弗氏完全佐剂充分乳化后进行第1次基础免疫，于兔背部皮下多点注射，每兔注射2mL；2周后进行强化免疫, 将一定量的葎草花粉粗制浸液同等量的弗氏不完全佐剂充分乳化，剂量同前。以后每隔1周进行一次加强免疫，剂量、部位同前。从第3次加强免疫开始，每次免疫后1周于兔耳缘静脉采血