精氨酸激酶折叠及去折叠机制的分析研究.pdfVIP

精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 ⑧ 摘要 2．7．3．3)是无脊椎动物中参与能 精氨酸激酶(ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC 量代谢的一种重要磷酸激酶。以中国对虾的精氨酸激酶(40kDa)为模式蛋白，研 究了蛋白质在六氟异丙醇溶液中的去折叠机制以及诱导出的二级结构对蛋白质 再折叠的影响。 利用内源荧光、ANS荧光、远紫外．圆二色光谱以及酶活力测定等手段研究 了精氨酸激酶在1，1，l，3，3，3．六氟异丙醇溶液中变性后结构与活性的变化。为避免 蛋白质聚沉的出现，实验中采用的变性剂浓度低于8％(v／v)。当六氟异丙醇浓度 范围为O．5％．1．5％时，蛋白质的二级结构和内源荧光发射峰位都没有发生明显的 变化，而外源ANS荧光强度则显著增强。继续提高变性剂浓度至6％后，内源荧 光发射峰位明显红移、二级结构含量增大、外源荧光减弱、酶活力完全丧失。比 较精氨酸激酶的失活与去折叠过程，结果表明酶的失活速度明显快于去折叠的速 度。内源荧光和外源ANS荧光的变化证明：在0．5％．1．5％六氟异丙醇浓度范围 内，蛋白质分子以一种结构相对稳定并类似于天然蛋白结构的熔球态中间体的状 态存在。这种熔球态中间体也是精氨酸激酶在去折叠过程中出现的一个平衡态中 间体。 在脲变性的精氨酸激酶中加入六氟异丙醇溶液，能诱导出大量的二级结构特 别是n．螺旋。折叠动力学研究表明，这些诱导出来的二级结构对精氨酸激酶的再 折叠产生阻碍作用，明显减缓了折叠的速度。而且当六氟异丙醇的诱导浓度为 5％时，这个阻碍作用是最显著的，而且再折叠过程中产生了部分不可见的聚沉， 蛋白质的活力丧失殆尽。可见，事先诱导的二级结构影响了蛋白质折叠的过程， 并导致了错误折叠的发生。 关键词：精氨酸激酶，熔球态，平衡态中间体，六氟异丙醇，折叠动力学，聚沉 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 ⑧ Abstract EC Argininekinase(ATP：L—argininephosphotransferase2．7．3．3)， an roleincellular metabolismininvertebrates． playsimpoaam energy kinasefrom takenasa Arginine shrimp(Feneropenaeus Chinensis)was model to the and effectsoftheinduced proteinstudyunfoldingprocess helicalstructureson refolding． Thedenaturationof kinase(AKlinvarious arginine of been l，1，l，3，3，3一hexafluoroisopropanol(HFIP)has investigatedby themethodsoffar-ultravioletcircular following intrinsic fluorescence．ANSand bind