重组类人胶原蛋白Ⅰ的分离纯化的分析研究.pdf

摘 要 本文主要研究重组类人胶原蛋白l的基因工程下游工艺。将基因工程菌 E’coliBL 21经高压匀浆、硫酸铵盐析、超滤浓缩后，得到类人胶原蛋白I的粗 品。再通过对离子交换批量层析与凝胶过滤层析相结合的方法和离子交换柱层析 一步法进行比较，得到了获得高纯度类人胶原蛋白I的优化工艺条件。 1粗提：采用高压匀浆法破碎20分钟，破碎率可达78．7％，破碎液中类人 胶原蛋白浓度达2．569／L用饱和度范围为20～50％的硫酸铵盐析，采用L9(34) 2．9，温度18C，蛋白浓度3 正交表，经方差分析确定盐析条件为pH g／L，盐析 后类人胶原蛋白纯度达36．8％，回收率达92．7％。 2纯化：采用了两种方法并进行了对比。(1)离子交换批量层析与凝胶过滤 层析相结合。采用批量层析的操作条件为：选用DEAE一52阴离子交换树脂，用 的条件下进行批量层析，吸附时间为60min。收集吸附后的上清液，经Sephadex G一100凝胶过滤层析柱，洗脱液为20mmoI／L NaCl)缓冲液。可获得纯度为97．6％的类人胶原蛋白I，总回收率为63．0％。(2) 离子交换柱层析一步纯化法。经实验确定离子交换柱层析的实验条件为：类人胶 NaCl含量为 原蛋白I起始进样浓度为39／L，以pH7．0、浓度为0．020mol／L 再分别以pH为6．0，浓度为0．01mol／L 缓冲液进行脱附，洗脱液体积为层析柱床层体积的12倍。可获得纯度为95．1％ 的类人胶原蛋白I，总回收率为77．O％。纯化后得到的类人胶原蛋白为卵清色液 体，从SDS．PAGE电泳图中可看出为单一条带，并且分子量为97kD，与基因序 W-E．N．P．G，与基因设计一致。 本论文还对离子交换批量层析和柱层析的动力学进行了研究，最终得到的批 量层析的液相溶质浓度随时间的变化表达式为：c=垒詈蓑等；柱层析的 穿透曲线模型为三Co。三[1+e玎(：一1。)]。比较两个模型所得的图形与实测图形表 明模型与实溯值吻合较好，采用零平均偏差分析对模型进行了验证，模型的A值 均小于置信概率为99％时的Fm』卜1值，证明了模型的有效性。 关键词：类人胶原蛋白I，基因工程菌，分离，纯化，层析，动力学 Researchon PurificationofRecombinantHuman—like I Collagen Abstract The to recombinanthuman—like I optimumprocessparameterspurify collagen (HLCI)were inthis recombinantE．colicellwas investigatedpaper．Harvested Pressure wastreatedammunition lysesbyHigh with sulfate， Homogenize，supematant after crude ofHLC1was two centrifugation，theproduct obtained．ConsequentlB Ion Batch Filtration methods，which purification ExchangCh