随机扩增多态dna的方法和应用111rapd技术的原理和特点.pdfVIP

第 11 章 随机扩增多态 DNA 的方法和应用 DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。 1990 年，Williams 和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams 等 1990； Welsh 等 1990）。尽管 RAPD 技术诞生的时间不长，但由于其独到的 DNA 多态性以及快速、 简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段 之一。本文将对 RAPD 技术的基本原理和特点、基本操作程序以及 RAPD 技术在检测物种遗 传多样性中的应用作一简单的介绍。 11.1 RAPD 技术的原理和特点 RAPD 技术建立在 PCR 技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十 聚体）为引物，对所研究的基因组 DNA 进行 PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖 凝胶电泳分离后，经 EB 染色或放射自显影来检测扩增产物 DNA 片段的多态性，这些扩增 DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的 DNA 多态性。 RAPD 所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组 DNA 序列 有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合 PCR 扩增 条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的 3 端相距在一定长度范围之内，就 可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生 DNA 片段的插入、缺失或碱基突变，就 可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR 产物的检测即可探知基因组 DNA 在这些区域内的多态性。 进行 RAPD 分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组 DNA 多态 性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD 可以 对整个基因组进行多态性检测。 RAPD 技术与其他 DNA 多态性检测技术如 RFLP（restriction fragment length polymorphism）、DNA 指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD 技术可以在对受试物种（包括动物、 植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作 简便，一次 RAPD 扩增实际上就是一次简单的 PCR 反应，适合大量样本的快速分析；③所需 模板 DNA 量极少，一般一次扩增只需 5～50ng 的 DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物 的排泄物中提取微量 DNA 进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因 组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa 等 1994；Yi 1995； 本章作者：陈永久，魏 伟，史宪伟，张亚平 第 11 章 随机扩增多态DNA 的方法和应用 131 Tibayrenc 等 1993；Wachira 1995）。 11.2 RAPD 的基本操作方法 RAPD 的操作方法大体上包括 DNA 提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操 作过程见 Williams 等（1990，1993）和 Welsh 等（1990）的论述。随着 RAPD 技术的发 展，该技术也作了一些改动（Bucci，Menozzi 1993；Dawson 等 1993；Lawson 等 1994）。 11.2.1 RAPD 模板的制备 11.2.l.1 动物组织总 DNA 的提取 取新鲜动物组织材料，如肝脏、肾脏或肌肉等 10～100mg，剪碎后加入 750µl 的 STE 3 3 3 （0.1mol／dm NaCl，20mmol／dm E