枯草芽孢杆菌分离及筛选鉴定实验方案.pdfVIP

HHJS-ZL 枯草芽孢杆菌的鉴定实验 1. 形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等） ⑴单个菌体的形态 ⑵群体形态的观察 2. 革兰氏染色 3. 芽孢染色 4. 菌体大小测量 5．枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定： 一 过氧化氢酶测定 1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧 2、试剂： 3— 10%过氧化氢 培养基：肉汤琼脂培养基 3、操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上， 30 培养 1—2 天。取一干净载玻片，在 上面加一滴 3—10%的过氧化氢，挑取一环培养 1—2 天的菌苔，在过氧化氢 溶液中涂抹， 若有气泡 （氧气）出现，记作过氧化氢酶阳性， 无气泡者为阴性。 也可将液直接加入斜面上，观察气泡的产生。 二 需氧性试验 1、原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌 的一个较重要指标。 2、培养基：半固体培养基 3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于 30 培养 3—7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌 三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理： 本实验是测定芽孢杆菌 （或其他细菌）发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖 产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰， 后者与蛋白胨中精氨酸所含 的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 V.P.试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸 以补充胍基，可加速反应。反应式如下： 2 丙酮酸—— 乙酰甲基甲醇 + 2 二氧化碳； -2H 乙酰甲基甲醇———— 二乙酰； +KOH 缩合 2 2 二乙酰 + NH=C(NH ) ———— 红色化合物 2、 培养基和试剂 培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，NaCl 5g ，蒸馏水 1000ml。调节 PH 6.5，每管分装 4—5ml ，0.06MPa （8lbf/in2 ）30min 灭菌 试剂： 40%NAOH(或 KOH) ，肌酸。 3、 步骤： 1. 接种与培养 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于 30 摄氏度培养 4 天。 2. 结果观察 在培养 4 天后，取培养液（约 2ml ）和等量的 40%NAOH 相混合，如少量肌酸 （约0.5— 1mg），充分振荡， 2—5min 后如培养液呈红色，即为 V.P.试验阳性， 有时须放置更长时间才出现红色反应。 四、淀粉水解 1、原理： 许多芽孢杆菌产生淀粉酶， 能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进 一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 2、 培养基及试剂： 培 养 基 ： 在 肉 汤 琼 脂 中 添 加 0.2% 的 可 溶 性 淀 粉 ， 分 装 于 三 角 瓶 。 0.1MPa(15lbf/in2)20min 灭菌备用。 试剂： 卢哥尔氏碘液 3、步骤： 将培养基融化后，冷却至 50 摄氏度左右，倒成平板，凝固后取菌种点钟于平板上