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论分离方法对移植卵巢卵泡发育影响 摘要：目的 评估机械法、酶解法和酶解机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，建立更好的卵泡分离技术方案。 方法 B6D2F1新生小鼠卵巢移植后分别用机械法、长时酶解法、短时酶解法或酶解机械结合法分离卵巢组织中的腔前卵泡，分离回收卵泡在体外培养12 d时加入绒毛膜促性腺激素(hCG)处理26 h，收获卵丘复合体进行体外受精。 结果 机械法的卵泡回收量、卵泡培养残存率、排卵率均高于酶解法，短时酶解法的排卵率高于长时酶解法;酶解机械结合法的平均卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率等多项指标均高于其他各组。 结论 酶解机械结合法是分离小鼠卵泡良好的技术方案。 关键词： 卵巢 卵泡 卵母细胞 培养技术 胚胎组织移植 　　人工诱导胚胎卵巢原始卵泡发育成熟可为受精机制研究和医疗性克隆提供充足的卵母细胞源。对异体移植发育到一定程度的卵巢进行生长卵泡分离是人工诱导卵泡发育的关键步骤之一[13]，迄今已经发展出两种卵泡分离技术，包括酶解分离法和机械分离法。这两种方法各有其缺点，使每个卵巢的卵泡回收率和成熟率均停留于较低水平。本研究探讨了酶解法、机械法和酶解机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，以期建立更好的卵泡分离技术方案。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 C57BL/6(B6)雌鼠、DBA/2(D2)雄鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[合格证：SCXK(沪)2007005]，以B6雌鼠和D2雄鼠交配繁殖B6D2F1(F1)小鼠。小鼠饲养于恒温(25 ℃)动物房单笼独立通风系统(IVCII型，苏州市冯氏实验动物设备有限公司)，光照14 h，黑暗10 h，自由饮水取食。 　　1.2 试剂 αMEMHEPES(42360032)，αMEM(32571036)，胶原酶I，脱氧核糖核酸酶(DNaseI，18047019)及ITS(胰岛素转铁蛋白硒混合物)均为美国Gibco公司产品; rFSH(注射用重组人促卵泡激素，瑞士Serono公司);LH(黄体生成素，美国Sigma公司);hCG(中国丽珠集团丽珠制药厂);FCS(胎牛血清)，penicillin/streptomycin(青霉素/链霉素)及KSOM AA(MR106D)均为美国Chemicon公司产品。 　　1.3 卵巢移植 B6雌鼠(8～10周龄)与D2雄鼠(10周龄)4∶1合笼培育F1代，次日查到阴栓者记为E0.5 d;以20 d为孕期，预产期前3 d每日早晚查看孕鼠是否生产;断颈处死新生12 h以内F1小鼠，取出双侧卵巢待移植。异戊巴比妥(15 mg/mL)麻醉成年(8～10周)F1雌鼠(移植受体)。消毒小鼠背部，在肋脊角区做纵向切口进入腹腔，切除双侧卵巢，然后在左侧肾被膜下植入新生小鼠卵巢2枚，层层缝合伤口。待受体鼠清醒后送回鼠舍。 　　1.4 卵泡分离 新生小鼠卵巢移植14 d后，将受体鼠断颈处死，从肾被膜下取出移植的卵巢，卵巢移植物约2 mm大小，表面可见丰富的重构血管，在体视镜下可清晰观察到卵巢移植物中的卵泡。用1 mL注射器(320310，美国BD公司)的针尖将每枚卵巢均匀横切为2块，4块卵巢组织混合后随机分组进行分离。 　　1.4.1 A组(单纯机械法) 将卵巢组织块转移至卵泡分离操作液(αMEMHEPES，10黃，100 IU/mL penicillin，100 mg/mL streptomycin，不含胶原酶和DNA酶)中，在带有37 ℃恒温热盘(MATSU55SZX2A，奥林巴斯)的体视显微镜下，用精细尖镊 (直5#，T1181，中国淮安特申医疗器械有限公司)剥离卵巢中的卵泡。每隔5 min，即将已剥离的完整卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液(αMEM，5黃，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1%ITS)的35 mm培养皿中。共分离4次，总时间约20 min。 　　1.4.2 B组(长时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3小块，置于500 μL卵泡酶解液(αMEMHEPES，3 mg/mL胶原酶I，1 mg/mL DNase I)中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化20 min，第20分钟时将其从培养箱取出，用200 μL移液枪吹吸消化液30次。在体视显微镜下将游离出的结构完整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中。　　 　　1.4.3 C组(短时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3块，置于500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化，每隔5 min即从培养箱中将组织取出，用200