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轮状病毒新型VP6基因拼接合成及序列测定 　 作者： 张彩红,张强哲,张彦明 【关键词】 轮状病毒；,VP6基因；基因,合成；,基因工程疫苗 【Abstract】 AIM: To design and obtain novel rotavirus (RV) VP6 gene. METHODS: On the basis of our previous reports, RV VP6 gene was optimized through the gradual splicing method, according to the improved PCR strategy. RESULTS: The optimized cDNA sequence of RV VP6 gene was successfully synthesized, which was about 1220 bp and reached 55% in (G+C) content. CONCLUSION: The optimized RV VP6 gene was obviously increased about 20% in (G+C) content compared to wildtype RV VP6 gene. This study laid a further strong foundation for the development of novel oral rotavirus genetic engineering vaccine. 【Keywords】 rotavirus; VP6 gene; genes, synthetic; genetic engineering vaccine 【摘要】 目的：设计获得轮状病毒（RV）新型VP6基因. 方法：本研究在前期工作的基础上，对RV VP6基因的优化合成方法进行了探索研究. 我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化改造. 结果：成功地合成了优化的RV VP6基因cDNA序列，该序列长约1220 bp，(G+C)含量达55%. 结论：与野生型RV VP6基因相比，优化合成的RV VP6基因(G+C) 含量提高了约20%，这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础. 【关键词】 轮状病毒； VP6基因；基因，合成； 基因工程疫苗 0引言 轮状病毒（rotavirus, RV）是引起全世界婴幼儿严重腹泻的重要病原,RV危害严重且无有效的治疗手段［1］,根除RV感染的惟一途径是发展安全、有效的疫苗,这已成为一个全球性的公共医疗目标,是一项十分迫切而必要的工作［2-5］. A组RV血清型众多,VP6蛋白是其主要的组特异性抗原,有较强的抗原性和免疫原性,可诱导保护性免疫. 有研究表明,VP6蛋白的IgA mAb对RV感染具有免疫保护作用,肌注免疫VP6 DNA疫苗可产生较好的异源保护作用［6］,以VP6蛋白和黏膜佐剂免疫小鼠可诱导产生对鼠RV EDIM株的完全保护作用［7］. 根据我国RV的感染状况,本课题组的疫苗设计方案主要包括A组RV的VP6抗原和A组RV G1，G2和G3型3种不同的VP7抗原. 前期免疫效果研究结果表明,灌胃免疫组产生的RV特异性免疫反应较滴鼻组弱,推测可能与疫苗在胃肠道受到胃酸和消化酶的降解破坏作用,导致其表达量降低和免疫效果弱化有关. 据此，为了发展新型高效的口服RV基因工程疫苗,我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化合成研究,以期提高其(G+C)含量,可望增加其表达量和提高以其为目标抗原的RV疫苗的免疫效果. 1材料和方法 1.1材料PcDNAⅡ质粒,E.coli DH5α菌种和E.coli DH10B菌种均为本室保存. Agarose Gel DNA purification Kit, Pyrobest DNA polymerase,T4 DNA Ligase, 限制性DNA内切酶KpnⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ，EcoRV,XGal, IPTG, DNA Marker DL2000, dNTP mixture和Amp均为Takara产品；RNA酶为Sigma产品； 酵母提取物和胰蛋白胨为OXOID产品； PEG(4000)为Promega产品. 1.2方法 1.2.1引物合成引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. 1.2.2RV VP6基因的优化合成根据RV VP6基因的氨基酸序列和人类细胞偏爱的密码子,重新设计了RV VP6基因的重组cDNA序列,合成了引物P11～P116和P21～P216与sP115和sP216. 根据嵌套式PCR方法制备突变体的原理［8］,