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酒精性肝纤维化中Smad4表达情况探究 　 作者:吴凌康 王小奇 任自立 叶 尉 摘要：目的 为了探讨Smad4在酒精性肝病肝组织中的表达和分布情况，揭示酒精性肝病的部分发病机制。方法 采用肝纤维化Masson染色考察酒精肝纤维化程度，用免疫组化考察Smad4分子在酒精性肝病肝组织中的表达，用RT-PCR方法考察Smad4在核酸水平的表达和分布情况。结果 正常肝组织和酒精肝早期，Smad4表达为阴性，酒精肝纤维化阶段Smad4表达显著阳性，主要分布在汇管区，壁周隙，纤维间隔等非实质细胞，进一步以PCR方法考察，发现正常组和酒精肝晚期组相比较，其Smad4的表达量有显著差异。结论 Smad4参与了酒精性肝纤维化。 [关键词] 酒精性肝病； 肝纤维化； Smad4； TGF-beta [Abstract] Objective To investigate the expression and role of Smad4 in ALD. Methods imumnohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction was used . Results There is no expression of Smad4 in normal liver and liver of earlier period ALD. Smad4 significantly increase in liver of late period ALD. They mainly distributed in portal area, perisinusoidal space and fibrous septa. Conclusion : Smad4 might be a important factor of fibrogenesis in late period of Alcoholic Liver Disease . [Key words] Alcoholic Liver Diseas Smad4 liver fabrosis TGF-beta 近年来随着酒精消耗量的增加，酒精性肝病的发病率呈上升的趋势，酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化肝硬化，该病的发病机制尚不明了，但肝纤维化无疑是该病后期的一个重要的病理改变。已有研究表明TGF-beta是肝纤维化的一个极重要的启动因子，而在TGF-beta下游存在一个复杂的Smads信息传导网络，Smad4是其中一个重要的信号分子，为了探察，Smad4是否参与酒精性肝病的发生发展，本实验以酒精灌胃制作大鼠酒精肝模型，以免疫组织化学和RT-PCR的方法考察了酒精肝组织中Smad4的表达和分布情况。 材料与方法 1、 实验动物 采用健康，性成熟，一级质量标准的S-D大鼠34只，雌雄各半，体重180-210g，分笼喂养。大鼠由浙大医学院动物中心提供。 2、 主要试剂:苏木素染料，丽春红染料，亮绿染料，兔抗大鼠Smad4多抗（一抗），辣根过氧化酶标记羊抗兔多抗（二抗），Trizol试剂，M-MLV逆转录酶，Tag酶，10mM/LdNTP PCR仪等。 3、 酒精肝模型 以上实验动物在浙大医学院动物中心以清洁二级喂养，随机分为两组，均为雌雄各半，白酒灌胃24只，三个月后处死10只取得肝脏标本，部分浸泡于10%福尔马林中留于病理检查，部分置于液氮中再保存于-80度冰箱中用于RT-PCR。六个月后再处死另一批11只老鼠处理同前。实验过程中死亡3只，原因不明。另10只免白酒灌胃，以等量生理盐水灌胃，6个月后全部处死，标本处理如上。因此大鼠肝脏标本分为：A组10只 正常对照组织；B组10只 酒精灌胃3个月组；C组10只 酒精灌胃六个月组。 4肝组织Masson染色观察 切片脱蜡脱水后苏木酸染色8分钟酒精分化水洗，1%丽春红酸性品红染色8分钟，水洗后1%磷钼酸染色6分钟，0.2%亮绿 5分钟，水洗，封片。 5、 免疫组织化学检测 用invision法，探测各组模型肝组织中Smad4的分布和表达强度，阳性对照由武汉博士德公司提供，另以动物羊血清代替一抗制作阴性对照，结果判定：镜下组织切片出现棕黄色染色则判为为阳性片。 6、 RT-PCR检测 （1）引物设计：从基因BANK检索Smad4基因的全序列（基因号AB010954），设计正链引物序列为5’ATCCTGGACATTACTGGCCGGTTCA3’反义链引物序列为5TGCCGCCTGGGCAGCAGCTGCGGCT3’。扩增片段为大小为500BP（2）内对照基因使用GAPDH，设计正义链为5-TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3’ 反义链为5GGCTAAGC