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分子生物学诊断技术进展 张 正 北京大学人民医院 主要内容： 分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用 简单介绍实验原理 以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例 分子诊断技术在以下病原研究的应用进展 乙型肝炎 丙型肝炎 结核分枝杆菌 病原学检测常用的实验室技术 细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术 电镜技术 分子生物学诊断技术 分子生物学诊断技术方法简介 分子诊断技术方法简介 2、多标靶同时检测 多重PCR 毛细管电泳 以测序分析为基础的检测技术 分子诊断技术方法简介 3、核酸杂交 DNA荧光原位杂交（FISH） 将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。 线性探针分析法（LiPA） 杂交保护分析法（HPA） 4、质谱 利用色、质谱结合PCR技术 分子诊断的功能及扩展 病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测---个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段 分子诊断的功能及扩展 疾病分型及意义 例如：HPV （30/100） 高危---16，18，31，45 低危--- 6，11 分子诊断的功能及扩展 病毒载量与治疗 例1. 分子诊断的功能及扩展 病毒载量与治疗 例2. HBV---干扰素 HBV100pg/mL 11/30 阴转 HBV100pg/mL 1/30 阴转 (HBeAg ?HBeAb) 分子诊断的功能及扩展 病毒载量与治疗 例3. HIV病毒载量与传播 15127人 流行病学调查415对伴侣 30个月 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA1500copies/mL 全阴 分子诊断的功能及扩展 病毒载量与治疗 例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发 15个二年持续缓解： 0 copy/mL 10个复发： 32250 copies/mL 17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高 耐药病原的分子诊断 WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用 HBV的YMDD变异 HIV耐药 血制品筛查 300余万的血清阴性样品，分子生物学复测： HBV：47 HCV：10 HIV-1：2 -2001年剑桥资料 HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6% -Am. J. Chin Athol. 2000 简单介绍实验原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应) 荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增） 定量PCR与定性PCR测定的区别 定量PCR测定的是扩增的指数扩增期; 定性PCR测定的是扩增的终点（平台期） 市场上常见的实时荧光PCR仪 NASBA测定原理 NASBA扩增原理 NASBA 和 PCR 的不同 乙型肝炎的分子诊断 乙型肝炎检测标志物： HBsAg，抗-HBs, HBeAg，抗-Hbe, 抗HBc (IgG,IgM), HBV-DNA 乙型肝炎的分子诊断 1. 重要性 全球 20亿人感染 慢性 3.5亿人 中国、东南亚、非洲50％肝硬化，70-90％肝癌 7-30％携带者感染变异体 乙型肝炎的分子诊断 2. HBV基因型与血清型关系及流行病学分布 基因型与血清型不完全一致 临床突变率不同 有地域分布特点 表1： 表1(续）: 乙型肝炎的分子诊断 3. 基因型与临床 实验室表现不同（表2） 病情与转归：C较B差 抗病毒治疗：A优于D B优于C adw/ayw 20:1 表2: 乙型肝炎的分子诊断 4. 一般实验室分型方法 测序 PCR-RELP（限制性片断长度多态性） PCR 核酸杂交（谱线探针法） 血清学：单抗可区分A-F各基因型 乙型肝炎的分子诊断 5. 抗病毒治疗的耐药性问题 拉米夫定耐药性的检测 乙型肝炎的分子诊断 乙型肝炎的分子诊断 乙型肝炎的分子诊断 HCV的基因型/亚型 1a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m 2a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m 3a, b, c, d, e, f, g, h, i,