B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力比较.doc

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力比较 　【摘要】 目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别。方法PCR扩增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisCXB及pcDNA3.1/HisCXC)。以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的Xpress多肽表位抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3Basic(重组载体为pGLMDR)。pGLMDR分别与pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC共转染HepG2细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性。实验数据以SPSS 11.5软件分析。结果成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体。Western blot显示pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC在HepG2细胞中均能表达HBV X蛋白,以转染后48 h为最高。当pGLMDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2~1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisCXB+pGLMDR组gt;pcDNA3.1/HisCXC+pGLMDR组gt;pcDNA3.1/HisC+pGLMDR组(对照组),且存在剂量效应关系。结论B、C基因型HBV X蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型。 【关键词】 肝炎病毒 乙型 癌 肝细胞 基因 病毒 反式激活（遗传学） 病毒蛋白质类 基因 MDR 药物耐受性 X蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)最重要的致病因子之一,可反式激活多药耐药基因1(multidrug resisitance gene 1,MDR1)[1],与HBV相关性原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)的高度恶性化及对化疗药物高度不敏感有关。研究表明B、C基因型HBV相关性HCC患者的临床表现及病理改变具有明显差别,而B、C基因型HBV X蛋白功能存在差异[24]。本研究拟通过分析B、C基因型HBV X蛋白对MDR1基因反式激活能力的差异,进一步探讨HBV基因型与致病性的相互关系。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1HBV DNA及肝细胞株pUC18XB(含B基因型HBV X基因的pUC18重组载体)及pUC18XC(含C基因型HBV X基因的pUC18重组载体)为本室保存。HepG2肝癌细胞株(美国组织细胞库,ATCC)。 1.1.2主要试剂DMEM培养基、DNAzol、胎牛血清、Westernbreeze试剂盒、Anti Xpress抗体、pcDNA3.1/HisC(美国Invitrogen公司);Expand High Fidelity PCR Kit、FuGENE6(美国Roche公司);phRLSV40,pGL3basic(美国Promega公司);质粒大量抽提试剂盒(美国Qiagen公司);Braford蛋白检测试剂盒(美国BioRad公司)。硝酸纤维素膜(美国Amersham公司)。 1.2方法 1.2.1HBV X基因表达载体构建PCR扩增目的片段,所用引物为: 上游(B基因)XbF:5CGGGGTACCCAGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAAC 3’(下划线为KpnI位点) 上游(C基因)XcF:5CGGGGTACCCAGCTGCTCGG GTGTGCTGCCAAC 3’(下划线为KpnI位点) 下游XbcR:5GCTCTAGATTAGGCAGAGGTGAA AAAGTTGC 3’(下划线为XbaI位点) 以pUC18XB为模板,引物XbF及XbcR用于扩增B基因型HBx(XB),以pUC18XC为模板,引物XcF及XbcR用于扩增C基因型HBx(XC)。扩增片段以XbaI及KpnI位点克隆于表达载体pcDNA3.1/HisC,经基因测序证实无误,所得克隆分别命名为pcDNA3.1/HisCXB(含B基因型HBx)和pcDNA3.1/HisCXC(含C基因型HBx)。 1.2.2MDR1基因启动子报告载体构建以DNAzol抽提HepG2细胞染色体DNA,取0.2 μg作为模板进行目的DNA扩增,引物设计根据参考文献[1],序列为: 上游MDRB:5CGAGCTCATCCTGCACTGTTTAGGGAGGGTT 3’(下划线为SacI位点) 下游MDRP3:5CTAGCTAGCTTTGAGCTTGGAAGAGCC