IL23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达中作用.doc

IL23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达中作用 　【摘要】 目的 探讨IL23在类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞核因子κB(NFκB)受体激活剂配体（RANKL）表达中的作用；并分析IL23诱导RANKL表达的信号传导通路。方法 分离RA和骨性关节炎(OA)患者滑膜成纤维细胞，分别加入不同浓度的IL23(1、5和10 ng/ml)，72 h后，实时荧光定量PCR(FQPCR)法检测RANKL mRNA表达。为了研究RANKL表达的信号传导通路，在成纤维细胞中分别加入PD98059、Ly294002、AG490 和Pathenolide孵育1 h，然后加入IL23刺激72 h，FQPCR法检测RA患者RANKL mRNA表达水平。结果 IL23能上调RA滑膜成纤维细胞RANKL表达；与之相反，IL23几乎不诱导OA患者成纤维细胞RANKL表达。加入PD98059、Pathenolide和AG490 后，IL23诱导RA患者滑膜成纤维细胞RANKL的表达明显被抑制。结论 IL23可能通过MEK1/2、NFκB和STAT3信号途径诱导RA滑膜成纤维细胞表达RANKL。 【关键词】 类风湿关节炎；RANKL；IL23；成纤维细胞；信号传导 类风湿关节炎(RA) 是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨破坏，最终引起关节功能障碍甚至残废。尽管目前对RA软骨损伤和骨质破坏的发病机制尚未完全阐明，但大量相关试验表明，破骨细胞在RA骨破坏的病理过程中起关键作用〔1〕；而核因子κB(NFκB)受体激活剂配体(RANKL)是破骨细胞形成和分化过程中的必需因子〔2〕。RANKL表达受许多细胞因子和其他免疫因子的调控。已经证明，RA的外周血、滑膜及滑液中存在的炎性细胞因子如IL1β，IL6、TNFα及IL17等都能促进RANKL表达。IL23是2000年新发现的一个炎性细胞因子，具有十分复杂的生物学功能，可通过分泌IL17促进RANKL上调〔3〕。但IL23能否直接作用于T细胞和滑膜细胞刺激RANKL生成及其信号传导途径尚不明确。本文将研究IL23对RA滑膜成纤维细胞RANKL表达的诱导作用，同时探讨IL23诱导RANKL表达的信号传导通路。 　　1 资料与方法 　　1.1 病例选择 　　选取RA患者5例，均符合1987年美国风湿病协会(ACR)修订的RA分类诊断标准〔4〕。其中女4例，男1例，年龄32～70岁，平均(57±8)岁。另选取年龄与性别相匹配的4例骨性关节炎(OA)患者为对照组。所有患者标本取材于全膝关节置换术或经关节镜滑膜切除术后的滑膜组织。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 成纤维细胞的分离与培养 　　取做过关节手术的RA和OA患者的滑膜组织，切碎后用4 mg/ml Ⅰ型胶原酶在37℃，5% CO2培养箱中消化4 h，溶解后的细胞以500 g离心，用含10％小牛血清的DMEM培养基过夜培养，次日去除非贴壁细胞，贴壁细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基继续培养，每隔3 d换液一次至细胞融合后传代，用4～8代的细胞进一步试验。 　　1.2.2 试剂 　　重组人IL23购自Ramp;D公司；NFκB抑制剂（Pathenolide）购自Sigma；丝裂原激活的蛋白激酶(MEK1/2)抑制剂（PD 98059），信号转导和转录激活剂(STAT3)抑制剂（AG 490）和 磷酰肌醇激酶3(PI3K)抑制剂（Ly 294002）购自Calbiochem(德国Schwalbach)。 　　1.2.3 RNA的提取和cDNA合成 　　把RA和OA成纤维细胞分别接种在100 mm2的培养皿上，当细胞长满后，在不同的培养皿上加入不同浓度的IL23 (1、5和10 ng/ml)，在37℃，5% CO2培养箱中孵育72 h，弃上清。在细胞中加入Trizol 1 ml裂解细胞提取RNA。在2.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计测量RNA含量。取2 μg RNA，合成cDNA。 　　1.2.4 实时荧光定量PCR(FQPCR)检测RANKL mRNA表达水平 　　根据GenBank中检索到的人RANKL序列设计并合成引物。取上述cDNA 2 μl，每个样本3复孔，终体积25 μl，使用Quant SYBR Green PCR kit(美国ABI公司)进行PCR。PCR反应条件：95℃ 10 min，扩增45个循环(95℃ 10 s，59℃ 10 s，72℃ 10 s) 。为了消除样本提取、逆转录和PCR反应过程中造成的差异，同时进行看家基因βactin mRNA表达的检测，△△Ct法比较RANKL mRNA表达水平。RAN