β防御素2真核表达载体构建及其在肝癌细胞Hepa16中稳定.docVIP

β防御素2真核表达载体构建及其在肝癌细胞Hepa16中稳定 　 作者：梅寒芳 金小宝 朱家勇 【摘要】 　　目的 克隆抗菌肽β防御素2（mBD2）基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa16细胞中稳定表达。方法 Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RTPCR扩增mBD2成熟肽基因,OverlapPCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，PCR、酶切和测序鉴定正确后，脂质体法转染Hepa16细胞,G418筛选,RTPCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果 成功克隆含有信号肽的IgКmBD2序列，并且构建pcDNA3.1(+)/IgКmBD2真核分泌性表达载体，实现了mBD2分子在Hepa16细胞中稳定表达，RTPCR从细胞总RNA中扩增得到202 bp的IgКmBD2基因，Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/IgКmBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa16细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础。 【关键词】 防御素；天然免疫；肝癌；OverlapPCR 【Abstract】 Objective To clone beta defensin