化痰活血软坚法干预肾小球硬化机理实验探究.docVIP

化痰活血软坚法干预肾小球硬化机理实验探究 　【摘要】 目的：探讨化痰活血软坚法防治肾小球硬化的作用机理。方法：将Wistar大鼠随机分为正常组，模型组和中药组。除正常组外，其余大鼠制成肾小球硬化大鼠模型。中药组大鼠灌胃中药（1 mL/100 g），其余两组灌胃等量蒸馏水，共12 w。然后观察各组大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9mRNA的表达。结果：与模型组比较，中药组大鼠肾组织TGF-β1和TGF-β1mRNA表达显著降低（P＜0.01），MMP-9mRNA表达显著升高（P＜0.01）。结论：减少肾组织TGF-β1的产生和分泌、促进MMP-9mRNA表达是化痰活血软坚法发挥效应的重要机理，而抑制TGF-β1mRNA的表达是减少TGF-β1产生和分泌的原因之一。 【关键词】 化痰活血软坚法 肾小球硬化 TGF-β1 MMP-9mRNA 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 Wistar大鼠，雄性，体重（180～200）ｇ，山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁 1.1.2 药品与试剂 化痰活血软坚汤由海藻、丹参、大黄、黄芪、当归组成。上药水煎2次，大黄后入，滤取药液合并，减压浓缩（80 ℃）为0.4 g/mL，低温保存备用。使用前放至室温并摇匀。亲和纯化兔抗人多克隆TGF-β1抗体：Santa Cruz Biotechnology，Inc.产品；FITC-羊抗兔IgG、TGF-β1mRNA原位杂交试剂盒、MMP-9 mRNA原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。盐酸多柔比星，深圳万乐药业有限公司生产，批号：0103Ｅ1，使用时以生理盐水稀释成1 ｍｇ/ｍL的溶液。 1.2 实验方法 1.2.1 动物分组 将40只Wistar大鼠随机分为正常组10只、模型组15只、中药组15只，自由饮水进食，1 w后进行实验。 1.2.2 模型制备 30只大鼠称重，腹腔注射（0.2 mL/100 g体重）1.75%戊巴比妥钠生理盐水溶液麻醉，从背部摘除左肾，缝合伤口。正常组行假手术，不摘除肾脏，余与上同。手术1 w后，30只造模大鼠尾静脉注射阿霉素5 mg/kg，手术5 w后注射阿霉素3 mg/kg。正常组尾静脉注射生理盐水。 1.2.3 给药方法 第1次注射阿霉素1 w后，中药组灌服中药（1 mL/100 g体重），正常组和模型组给予等量蒸馏水。连续给药12 w。 1.2.4 标本采集 摘取右肾，迅速冠状切开，分别以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蜡包埋。甲醛固定组织切片厚度4 μm，多聚甲醛固定组织切片厚度6 μm。 1.2.5 指标观察 1.2.5.1 肾组织TGF-β1检测 采用免疫荧光细胞化学技术。兔抗人TGF-β1抗体1∶100稀释，PBS代替一抗作为阴性对照。激光共聚焦显微镜观察，并用Laser Micrscope LSM510 Version 2.5 SP2软件处理，每张切片任选5个视野，计算其平均荧光强度，作为该样本TGF-β1的相对表达量。 1.2.5.2 肾组织TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA检测 采用原位杂交法。OLYMPUS BX41光学显微镜观察，每张切片任选10个肾小球，OLYMPUS C-4000ZOOM数码相机照相（光亮度设定一致），用Image-proplus 4.5图像分析软件对结果进行半定量分析，每张切片随机选取10个视野，测定10个视野的积分光密度，以均值作为该样本MMP-9mRNA的相对表达量。 　 1.2.6 统计学方法 数据以均数±标准差（x±s）表示，数据统计以SPSS11.0统计分析软件进行单因素方差分析。 2 结 果 2.1 各组大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9 mRNA的表达 结果见表1。 由表1可知，模型组大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1表达显著高于正常组（P＜0.01），中药组大鼠二者的表达显著低于模型组（P＜0.01）。模型组大鼠肾组织MMP-9mRNA表达比正常组显著降低（P＜0.01），而中药组大鼠肾组织MMP-9mRNA表达则比模型组显著升高（P＜0.01）。 3 讨 论 TGF-β1是肾小球疾病进展的重要介导因子，在免疫介导及非免疫介导的肾脏损伤模型中，系膜细胞、内皮细胞及浸润巨噬细胞均可合成TGF-β1。在慢性肾衰复杂的病理机制中，如肾小球的高灌注、高滤过，肾小管损伤和间质纤维化，蛋白尿促进肾小球间质纤维化等多个环节均有TGF-β1参与。TGF-β1促进系膜细胞产生部分ECM并抑制其降解，增加细胞对ECM的黏附，促进ECM在肾小球内积聚，并有调节多种细胞因子的作用，从而直接参与肾小球硬化过程。肾脏