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家族性帕金森病一家系临床特征及PARK1基因突变分析 　 作者：张颖 胡国华 陈秋惠 张海娜 胡馨予 姜立刚 【摘要】 目的 探讨一帕金森病(PD)家系的临床特征及进行PARK1基因G88C(位于3号外显子)、G209A(位于4号外显子)突变分析。方法 该家系祖籍为吉林省白山市，汉族，可追溯4代25人，其中9例发病(3人已去世)，4人可疑。家系图谱分析为一常染色体显性遗传大家系，总结该家系发病的临床特征。采家系成员外周抗凝血提取基因组DNA，利用聚合酶链限制性长度多态性分析(PCRRFLP)技术检测PARK1基因第3、4号外显子是否存在突变。所得产物利用琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析系统进行分析。结果 该家系有典型PD临床表现，且具有发病年龄早、发病成员临床症状相似等特点。采集的所有血标本的扩增产物分别经MvaI和NmucI酶切后未见小分子片段，未发现G88C、G209A错义突变。结论 该家系为以震颤及强直为主要临床特征的常染色体显性遗传PD大家系，该家系不存在PARK1基因错义突变。有待于进一步查找该家系的致病基因。 【关键词】 帕金森病;家系;基因;限制性片段长度 近年来的研究表明帕金森病(PD)的发病具有遗传学基础，随着家族性PD致病基因的相继定位与克隆，分子遗传学在PD发病机制中的作用越来越受到关注。家族性PD虽少见，却为研究PD的遗传因素提供了极好的机会和条件，为探索PD的发病原因及新的治疗方法提供思路。PARK1(αsynuclein)是首先被发现的与遗传性PD有关的基因，已有两个点突变G88C和G209A被确认。目前关于PARK1基因突变在我国大的PD家系中的研究报道较少，尤其是在北方的家系研究中未见，本文对搜集到的一个北方PD常染色体显性遗传大家系进行研究，筛查是否存在PARK1的G88C及G209A错义突变。 　　1 资料与方法 　　1.1 家系资料 该家系祖籍为吉林省白山市，汉族，可追溯4代25人，其中9例发病(3人已去世)，4人可疑，呈常染色体显性遗传模式。见图1。PD临床诊断依据2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组制定的PD诊断标准。该家系发病成员起病年龄为20～40岁，具有典型PD症状，均以震颤及强直起病，伴有不同程度的PD非运动症状，无明显智能减退，口服左旋多巴治疗有效，症状逐年加重。先证者女性，1951年出生，于1997年于吉林大学第二医院神经内科确诊为PD。查体(服息宁控释片50/200半片后1 h)：血压110/70 mmHg，面部表情僵硬，双腕部张力呈齿轮样增高，双上肢肌张力轻度铅管样增高，双下肢肌力铅管样增高，以右侧肢体为重。走路协同动作减少，前驱前倾体姿。病理反射阴性。常规生化检查未见异常，头部MRI未见异常。共搜集6名已发病患者的临床及血液样本资料，并搜集家系成员12例血液样本。 　　图1 帕金森病一家系图谱 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA提取 所有家系成员均取肘静脉血8 ml枸橼酸钠抗凝，采用TaKaRa全血基因组DNA提取试剂盒提取白细胞基因组DNA。 　　1.2.2 聚合酶链反应(PCR) PARK1 3、4号外显子PCR引物序列均参照Polymeropoulous文章〔1，2〕。见表1。引物均由上海sagon公司合成，反应体系含：50 ng/μl gDNA 2.0 μl，100 μmol/L dNTP 2.0 μl，50 ng/μl引物各1.0 μl，10×PCR缓冲液(含MgCl2)5 μl，Taq酶0.2 μl，加ddH2O至50 μl，10×PCR缓冲液和Taq酶均由TaKaRa公司生产。PCR反应条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，外显子3 49℃(外显子4 55℃) 30 s，72℃ 40 s，共30个循环;72℃ 延伸6 min。以1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下观察结果，并用TaKaRa PCR产物纯化试剂盒对产物进行纯化，利于酶切反应。表1 扩增PARK1 3、4号外显子片段所用引物序列 　　1.2.3 限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP) PCR纯化产物各取20 μl，分别用限制性内切酶MvaI(外显子3)及NmucI(外显子4)在37℃恒温下酶切4 h(两种限制性内切酶产地为MBI)，产物以1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统下观察结果并摄像。若存在G88C突变，外显子3产物可被MvaI酶切为136和56 bp两个片段;若存在G209A突变，外显子4产物可被NmucI酶切为128和88 bp两个片段。 　　2 结 果 　　18名家系成员(包括已发病的成员)的DNA模版，经PCR 　　扩增后均获得了192 bp及216 bp的产物，所有产物分别经过MvaI(外显子3)及NmucI(外显