异丙酚对大鼠急性自体血栓肺栓塞保护作用.docVIP

异丙酚对大鼠急性自体血栓肺栓塞保护作用 　 作者：霍华治 苏春勇 马小刚 【摘要】 　　目的 观察异丙酚对急性自体血栓肺栓塞大鼠的保护作用及机制。方法 制备急性自体血栓肺栓塞模型，大鼠分为正常对照组、模型组、异丙酚低、中、高剂量组(4,8,16 mg·kg-1·h-1)。进行血气分析；检测肺系数、肺组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性；放射免疫法检测血液中内皮素（ET1）、血栓烷素2（TXB2）含量；RTPCR和Western印迹方法检测肺表面活性蛋白A（SPA）mRNA及蛋白的表达。结果 异丙酚能升高血氧分压、血二氧化碳分压水平、SOD活性、SPA mRNA和蛋白表达；降低肺系数、MDA、ET1、TXB2含量。结论 异丙酚对急性肺栓塞大鼠有保护作用。 【关键词】 异丙酚；肺栓塞；肺表面活性蛋白A 　　急性肺栓塞是一种误诊率和病死率很高的疾病，且随着年龄增加其发病率和死亡率愈高〔1〕。异丙酚是一种较新型的静脉麻醉药物，在发挥麻醉效应的同时，因其静脉输入，可对全身组织产生不同的影响。已有研究表明异丙酚对急性肺栓塞有保护作用〔2〕，但在急性自体血栓肺栓塞中的作用研究不多，而自体血栓的形成和临床肺栓塞症血栓的形成具有一定的相似性，能更真实地反映疾病的病理生理改变，因此本文通过制备大鼠自体血栓急性肺栓塞模型来研究异丙酚对急性肺栓塞的作用并初步探讨其机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　SD大鼠，清洁级，雄性，280～300 g，由河北省实验动物中心提供，异丙酚由四川蜀乐药业股份有限公司提供，肺表面活性蛋白A（SPA）引物由上海生工生物技术公司合成，抗SPA单克隆抗体购自Sigma公司。 　　1.2 大鼠肺栓塞模型建立〔3〕 　　尾静脉取血0.2 ml，37℃水浴箱内过夜，次日分割成5 mm ×1 mm的栓子，放入2 ml的注射器内备用。大鼠用20%乌拉坦麻醉，颈正中切开，分离右侧颈总静脉，采用导管方法将混有15个血栓的2 ml生理盐水注入静脉。注入血栓后可见大鼠明显发绀，呼吸加快。 　　1.3 动物分组与给药 　　SD大鼠40只，随机分为正常对照组、模型组、异丙酚低剂量：4 mg·kg-1·h-1、异丙酚中剂量：8 mg·kg-1·h-1、异丙酚高剂量组：16 mg·kg-1·h-1。每组8只动物。除正常对照组外，各组注入栓子，异丙酚各组再分别继续输注异丙酚4、8、16 mg·kg-1·h-1(用5%葡萄糖稀释)4 h，模型组继续输注 5%葡萄糖2 ml/h。对照组颈静脉输注生理盐水。输注异丙酚 4 h时，腹主动脉取血处死动物。 　　1.4 检测指标与方法 　　1.4.1 血气分析 　　各组实验动物于栓塞前、栓塞后、输注异丙酚后，分别颈总动脉取血作血气分析。 　　1.4.2 肺系数 　　仔细切除肺外支气管和脂肪组织，称肺重，计算肺系数=肺重/体重。 　　1.4.3 丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定 　　称取一块肺组织，匀浆，离心，取上清，按试剂盒的要求采用比色法测定。 　　1.4.4 内皮素 　　1（ET1）和血栓烷素2（TXB2）含量测定 取全血，按说明采用放射免疫法测定。血栓素（TXA2）生物半衰期短，迅速代谢为稳定而基本无活性的TXB2，难以直接测定，国内外均以测定TXB2作为判断其浓度的指标。 　　1.4.5 肺组织形态学变化 　　常规苏木素尹红（HE）染色。 　　1.4.6 大鼠肺组织肺表面活性蛋白（SPA）mRNA及蛋白检测 　　1.4.6.1 RTPCR方法检测SPA mRNA表达 　　①提取肺组织总RNA；②进行逆转录；③PCR扩增SPA目的片段，引物序列：SPA 上游引物：5′CCTTCACCCTCTTCTTGACTGT3′，下游引物：5′CAATGTTGCCTCCTGCTCTG3′。βactin上游引物：5′CAGGGTGTGATGGTGGG3′，下游引物：5′GGAAGAGGATGCGGCAG3′。 PCR条件为95℃ 5 min,预变性后，95℃ 30 s，58℃ 30 s,72℃ 30 s,25个循环后，72℃延伸5 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析。βactin作为内参照。 　　1.4.6.2 Western印迹法检测SPA蛋白的表达 　　取肺组织提取蛋白质，定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，用抗SPA单克隆抗体（1∶400）或βactin单克隆抗体（1∶800）4℃孵育过夜，PBS漂洗三次后加二抗辣根过氧化酶（HRP)IgG (1∶1 000)，室温孵育2 h，化学发光法显色，显色终止后在