异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞蛋白双向电泳图谱差异.docVIP

异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞蛋白双向电泳图谱差异 　【摘要】 目的 利用蛋白质组学方法，识别异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞（SM细胞）后差异表达的蛋白质，为进一步深入探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。方法 观察不同浓度的异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌生长曲线，确定药物处理SM细胞的最佳时间和浓度，并提取在最佳处理时间和浓度条件下的SM细胞总蛋白，采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞的总蛋白质，用PDuest 7.3.1图像分析软件比较分析，以识别差异表达的蛋白质。结果 在空白对照组检出159个蛋白斑点，在异烟肼处理组检出221个蛋白斑点，在相对分子质量30 000~90 000和pH值4.5~6.0 范围内，异烟肼处理组蛋白斑点数均多于空白对照组。 结论 异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞的蛋白质组具有差异，提示异烟肼处理后促进了某些特定基因的表达。 【关键词】 异烟肼；耻垢分枝杆菌 mc2155；双向电泳；蛋白质组比较 　　结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis，M.TB) 是引起结核病的病原体。结核病是除AIDS外引起死亡最高的感染性疾病，是严重的全球性健康问题[1]。抗结核药物是结核病化学治疗的基础，因此，结核病的化学治疗目前是人类控制结核病的主要手段[2]。结核病治疗的两大难题在于结核分枝杆菌的持留性和耐药性，这些问题使得结核病不能得到快速而有效的治疗。在2000年，全世界约有273 000例新增的结核耐药病例，占所有结核病3.2%[3]。因此，随着人们对结核分枝杆菌认识的逐步深入，发现新的药物作用靶点，研究和开发靶向结核分枝杆菌的新型抗结核化疗药物，对控制和治疗结核病具有重大意义。异烟肼（Isoniazid, INH）作为全效杀菌剂，一般认为，其作用机制是在结核分枝杆菌细胞内被过氧化氢过氧化物酶（KatG）氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物， 参与辅酶Ⅰ（NAD）的合成并使其不能起同功酶的作用而抑制细胞壁分枝菌酸的合成， 使结核杆菌损失细胞壁的完整性及其抗酸性，细胞壁保护及抵抗氧化、侵袭的屏障功能受损。随着碳水化合物、氨基酸和磷酸盐的丢失，最终导致结核分枝杆菌死亡[4]，但是否存在其他作用靶点，尚不清楚。本研究利用与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构， 但生长快速且无致病性的耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis) mc2155菌株作为实验模型，应用比较蛋白质组学技术，观察异烟肼处理后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞蛋白表达谱的变化，从蛋白质的水平探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制，并寻找新药作用靶标，为新型抗结核病药物的研究开发奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌种及试剂 M. smegmatis mc2 155菌株由美国科罗拉多州立大学微生物系分枝杆菌研究室惠赠。异烟肼购自上海信宜制药厂；LB培养基购自美国Invitrogen/GIBCO公司；载体两性电解质(ampholyte)，尿素(urea)，硝酸银，丙烯酰胺(acrylamide)，甲叉双丙烯酰胺(Bis)均为美国Sigma公司产品；Tris，SDS，甘氨酸(glycine)购自北京华美公司；低相对分子质量标准蛋白质购自北京天为时代公司；其他试剂为国产分析纯试剂。 　　1.2 仪器 圆盘电泳槽，大连竞迈生物科技有限公司；高压电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；MV II型垂直板电泳槽，大连竞迈生物科技有限公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；微量进样器，法国Gilson公司；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表厂离心机厂；pH计，意大利HANNA公司；THZ92B台式恒温振荡器，上海跃进医疗器械厂；AEG120电子分析天平，日本岛津公司。 　　1.3 细菌生长曲线 将冻存管中耻垢分枝杆菌20 μl 接种到2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 振荡培养，每3 h 于600 nm 处测定细菌培养液的OD值，待OD值达到0.7时，分别在各组培养基中加入终浓度为0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.08 mg/L，0.16 mg/L 和0.32 mg/L 的INH；每3 h 于600 nm 处测定空白组，INH处理组细菌培养液的OD值，绘制生长曲线，确定INH的最佳处理时间及浓度。 　　1.4 细菌总蛋白的制备 将耻垢分枝杆菌20 μl 悬液接种到2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 振荡培养，取对数生长期细胞进行实验。分别在培养基中加入终浓度为0.08 mg/L 的INH，空白对照组加与INH等体积的无菌水，继续培养3 h 后收获细菌。50 mmol/L