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弓形虫多表位DNA疫苗构建及其免疫保护作用 　【摘要】 目的: 构建弓形虫多表位DNA疫苗并研究其免疫保护效果。方法: 将编码含弓形虫多个T、 B细胞表位的6段弓形虫多肽基因, 以5个甘氨酸编码基因相间隔相连接, 克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(＋)中, 构建成多表位弓形虫DNA疫苗。免疫BALB/c小鼠, 测定其诱导的特异性抗体水平及T淋巴细胞增殖状况, 同时进行弓形虫攻击感染保护实验。结果: 成功构建了包含多个弓形虫表位的真核表达质粒pcDNA3.1/TME, 以其作为DNA疫苗免疫小鼠, 可诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答, 产生有效的抗弓形虫保护性免疫应答。结论: 构建的弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答, 在控制弓形虫感染上具有可行性。 【关键词】 弓形虫 表位 DNA疫苗 　　刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种人兽共患寄生虫病, 广泛流行于我国及世界各地, 全球感染率高达25%～35%, 我国人群感染率为5%～20%。成人感染弓形虫后多呈无症状带虫者, 孕妇感染后可造成流产、 胎儿畸形以及胎儿死亡等不良妊娠结局, 免疫功能受抑制或有免疫缺陷的患者合并弓形虫感染时, 可成为患者死亡的主要原因之一［1, 2］。近年来, 国内外学者在弓形虫疫苗的研究上进行了大量的探索工作, 大致经历了全虫疫苗、 虫体特异组分疫苗和核酸疫苗等阶段, 但均尚未研制出安全有效疫苗。动物实验发现, 弓形虫全虫疫苗、 特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染程度作用, 但前者可能会引起再感染, 后者的免疫保护效果较差［3-5］。弓形虫病核酸疫苗有望弥补上述疫苗存在的不足, 具有良好的开发应用前景, 但目前研究尚处于初始阶段, 而且对弓形虫多表位DNA疫苗的研究尚缺乏报道。本研究中我们将编码含弓形虫多个T、 B细胞表位的6段弓形虫多肽基因（分别编码SGA1 238～256aa、 SGA1 281～320aa、 GRA1 170～193aa、 GRA4 331～345aa、 GRA4 229～245aa和GRA2 171～185aa）, 以5个甘氨酸编码基因相间隔进行连接, 克隆入真核表达质粒pcDNA3.1中, 构建成多表位弓形虫DNA疫苗, 以期获得更好的免疫保护效果, 为构建安全有效的多表位弓形虫DNA疫苗提供理论和实践基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pcDNA3.1(+)、 大肠杆菌DH5α及弓形虫RH国际标准株均为本室保存。核酸内切酶EcoR I、 BamH I, T4连接酶购自美国MBI公司。胎牛血清购自天津正江生物公司。兔抗小鼠IgGHRP购自博士德公司。TMB为美国Sigma公司产品。RPMI1640为美国Gibico公司产品。MTT（四甲基偶氮唑盐）为美国Amresco公司产品。96孔细胞培养板购自丹麦Costor公司。BALB/c及ICR小鼠购于西安交通大学实验动物中心。 　　1.2 方法 　　1.2.1 真核表达载体pcDNA3.1/TME的构建 目的基因片段, 包含编码弓形虫SGA1 238～256aa、 SGA1 281～320aa、 GRA1 170～193aa、 GRA4 331～345aa、 GRA4 229～245aa和GRA2 171～185aa 6个多肽片段的基因（GenBank S76248, M26007, M76432, L01753）, 每片段间以5个甘氨酸编码基因相间隔进行连接, 并在5’端添加了BamH I酶切位点和ATG启动密码子, 3′端添加了TAA终止密码子和EcoR I酶切位点, 共483 bp, 由上海生工生物工程技术有限公司合成。按常规方法将该目的基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+) BamH I和EcoR I酶切位点之间, 转化大肠杆菌DH5α, 重组质粒经DNA测序鉴定无误后, 命名为pcDNA3.1/TME。 　　1.2.2 质粒的大剂量提取及纯化 碱裂解法分别大剂量提取重组质粒pcDNA3.1/TME和空质粒pcDNA3.1, 并用聚乙二醇沉淀法纯化后, 经紫外分光光度计定量, 溶于灭菌去离子水中, 浓度均为1 g/L。 　　1.2.3 动物免疫 SPF级雌性6周龄BALB/c小鼠32只, 随机分为两组, 即注射pcDNA3.1空质粒的对照组和注射重组质粒pcDNA3.1/TME的实验组, 每组16只。每只小鼠均先用2.5 mL/L盐酸布比卡因50 μL分别注射小鼠双侧胫前肌进行预处理, 3 d后在小鼠双侧胫前肌相同部位各注射50 μL（50 μg）质粒, 每只小鼠每次免疫的质粒总量为10