干扰素生产工艺 - 副本.pptVIP

课件制作人：刘海燕 概念： （interferon，IFN） 干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon，简称IFN。 发现： 干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。?  干扰素的理化性质 143-166aa； MW:18-40 ku； pI: 6.5-7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纤维膜、琼脂和塑料等介质。 工艺流程 基因工程假单胞杆菌的构建 摇瓶培养 发 酵罐培养 菌体收集 菌体裂解 预处理-沉 淀 初级分离 溶解粗干扰素 沉淀 与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子 交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分 装 检测 30℃，pH7.0 18±2h 30℃，pH7.0 16000 r/min离心 2℃～10℃ 16000 r/min 干扰素生产工艺路线（1） 干扰素生产工艺路线（2） 干扰素生产工艺路线（3） 上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。 干扰素生产工艺路线（4） 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格 动物无限细胞系培养生产工艺： 干扰素生产工艺路线（5） 宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性 工艺特点： ①发酵周期短（几个小时） ②无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺 一、基因工程假单胞杆菌的构建 基因工程假单胞杆菌菌种建立 基因工程假单胞杆菌菌种特性 （一)-基因工程假单胞杆菌菌种建立 第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建 第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR) 制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。 第二步：表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体 第三步：工程菌构建 转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种 （二）基因工程菌的特性 （1）具有宿主菌的特征： 细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状,粘稠。 生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为 （2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR （3）具有生产干扰素能力：放射性免疫学效价不低于2.0×109 IU/L。 二、干扰素α-2b的发酵工艺过程 1、摇瓶培养 取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。 2、种子罐培养 接种：接入50L种子罐，接种量10%。 培养：30℃，pH7.0。 控制：级联调节通气量和搅拌转速，DO为30%，3～4h，OD4.0。 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。 3、发酵罐培养 接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。 控制：