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第一部分 免疫沉淀类实验 微生物与免疫教研室 一、抗原抗体制备技术 抗体：是B淋巴细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。 单克隆抗体：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。 多克隆抗体：由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。 抗体制备分三个阶段 抗原的制备与纯化1.抗原的制备与纯化 动物免疫2.动物的选择 血清分离纯化与鉴定 抗原 抗原：是一类能够诱导机体免疫应答并能与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。具有免疫原性和免疫反应性。 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 a.根据抗原性不同，分为完全抗原和不完全抗原。 b.根据化学性质分为蛋白质抗原、类脂抗原、多糖抗原和核酸抗原。 c.根据物理性状分为颗粒性抗原和可溶性抗原。常见的颗粒性抗原主要是细菌或动物细胞。 返回 动物的选择 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。 一般，抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。 免疫用的动物需选择适龄、健康、体重合适的动物，最好为雄性。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。 实验室制备抗体，多选用家兔和绵羊。 抗原剂量的选择 小鼠首次抗原剂量为：50-400μg/次 大鼠为100-1mg/次 兔子为200-1mg/次 加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5 途径 免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。 颗粒性抗原多克隆抗体的制备 --伤寒杆菌O抗血清的制备 1、伤寒杆菌O抗原的制备： 2、免疫方法： 选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀释好的抗原按下列剂量及程序做皮内或静脉注射。第一天注射1ml，第8天注射1.5ml，第15天注射2ml，末次注射后7天颈动脉放血，测效价。 可溶性抗原多克隆抗体的制备 佐剂 概念：预先与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。 种类：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂 。 佐剂 主要作用机制： ①改变抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内滞留的时间 ②刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力 ③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力 弗氏佐剂 动物实验中最常用的佐剂： ①弗氏不完全佐剂(incomplete Freunds adjuvant IFA) 羊毛脂 1 份 +石蜡油 5 份，混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。 ②弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant,CFA) 弗氏不完全佐剂 10ml +卡介苗 10mg～200mg 卡介苗可100℃10min灭活处理。 免疫乳剂制备成功的判别标准 油包水状态 鉴定方法是将乳化剂滴入4℃左右冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。  免疫 将制成的乳剂吸入注射器，在兔子背部及颈部皮下注射8-10点，每点约0.2ml 每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多点注射加强免疫,每点0.2ml,共加强2次. 第二次加强免疫开始,在免疫后第7天用免疫双扩散法检查抗体效价. 抗体的分离鉴定及保存 见教材p22-26 二、沉淀反应（precipitation） 是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 沉淀反应的特点 抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖 沉淀反应分两个阶段： 第一阶段、抗原抗体特异性结合 第二阶段、形成可见的免疫复合物 分类 1.絮状沉淀反应（flocculation） 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。 代表试验：曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验，现今已被更简便而敏感的血清不加热反应素试验 (USR)或快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)方法替代。 原理： 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉