神经节苷脂GM-%2c3-对表皮生长因子受体在人单核样白血病J6-2细胞脂筏中分布及磷酸化影响.pdfVIP

神经节苷脂GM。对表皮生长因子受体在人单核样白血病 J6—2细胞脂筏中分布及磷酸化的影响 硕士研究生：王凯 指导教师：马克里 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 神经节苷脂GM3作为生理性促分化剂已在多个瘤株模型中得以证 实，但其诱导分化的详细机制仍不清楚。我们前期工作发现，GM、诱 导人单核样白血病J6．2细胞沿单核／巨噬细胞途径分化的同时，可抑制 J6．2细胞表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化活化，从而下调细胞内PLC Y／DAG／PKC Q信号通路。同时也有不少作者报导了GM3对其它细胞 EGFR也有抑制作用。但其抑制机制至今仍不清楚。近年来，细胞膜脂 筏理论的提出，为进一步深入研究细胞信号跨膜传递的分子机制开辟 了新的途径。已知脂筏对EGFR主要起负调作用，促进EGFR在脂筏 中的分布，可抑制EGFR与配体结合及活化。因此本文着重观察了GM3 对EGFR在脂筏内外分布的影响，及对EGFR的酪氨酸残基磷酸化影 响情况，进一步揭示GM3抑制EGFR磷酸化的分子机制。 要研究GM，对EGFR在脂筏内外分布的影响，其前期工作就是脂 筏的制备与鉴定。通常我们是利用脂筏在低温下不溶于非离子去垢剂 这一特性，采用蔗糖密度梯度超速离心对其进行分离。然后将脂筏富 含的神经节苷脂GMl作为脂筏的标志分子，采用标记的霍乱毒索．B亚 toxinBsubunit，CTB)对其进行亲和标记，以确定脂筏在离心 基(cholera 后各部分样品中的分布。由于此方法操做复杂，费时，易对环境造成污 染。为此，我们对不同组织细胞的脂筏组分进行了分析研究，创建了 一种新的鉴定脂筏的方法。 ·1。 本文利用蔗糖密度超速离心、有机溶剂提取和高效薄层层析技术 组分包括鞘磷脂，鞘糖脂，胆固醇，及GPI锚定蛋白(CDl4)进行了 分析，同时与点杂交及霍乱毒素亲和标记方法相比较，结果发现鞘磷 脂是一种特异性高，适用广泛又便于检测的脂筏标记分子，从而为脂 筏的分离鉴定提供了一个新的有效的实验方法。 采用SDS—PAGE，Western blotting及酶联免疫显色技术，并结合 计算机半定量扫描技术，检测了GM；处理前后EGFR在脂筏中的分布情 况。结果发现：G№处理组J6—2细胞脂筏中EGFR分布明显增多。这一 结果说明，GM3促进了EGFR在脂筏中的分布。进一步对GM3处理前后 EGFR的酪氨酸磷酸化水平进行研究。结果显示：GM3处理组非脂筏部 分样品EGFR磷酸化程度低于对照组。脂筏所分布的部分未见EGFR 磷酸化。说明分布于脂筏中的EGFR磷酸化受到抑制。 综上结果，作者推测GM，对EGFR的影响可能有两个方面：一是 GM，作为脂筏的重要组分之一，增加了细胞表面脂筏所占面积，使分 布于脂筏中的EGFR增多。另一方面GM3可借助于与EGFR—N糖链结 构识别结合，进一步诱导EGFR向脂筏中分布，其结果促进EGFR向 脂筏中分布，使其不易与配体结合，抑制其三聚化及磷酸化活化。 关键词：神经节苷脂GM3脂筏 表皮生长因子受体 ·2- on Effectsof thedistributionof Ganglioside。GM3 in GrowthFactor the Epidermal Receptorlipid LeukemiaJ6．2cellLine Human raftsof MS Kai