猴头菌原生质体制备及单核体鉴定研究.PDF

中国医药生物技术 2015 年4 月第10 卷第2 期 Chin Med Biotechnol, April 2015, Vol. 10, No. 2 113 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.004 ·论著· 猴头菌原生质体制备及单核体鉴定研究 张琪，刘宏伟，陈娟，郭顺星 【摘要】 菌株发育而来，含有两套不同的染色体，基因组复 目的 通过优化猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色 杂度较高，测序解析困难。因此获得单核体是基因 鉴定及分子鉴定获得高纯度的单核体，为进一步开展猴头菌 组测序工作的前提和基础。在获得单核体的方法 基因组水平的研究提供材料。 中，原生质体单核化法所获得的单倍体菌株不经过 方法 对三类酶系统、溶壁酶浓度、无机和有机两类稳渗剂、 重组，因而更能完整地展示二倍体亲本的遗传信 pH 3.5 ~ 6.5 、酶解温度 20 ~ 40 ℃、培养基成分以及菌龄为 息[3] 。然而单核体的再生有一定的困难，所以需要 48 ~ 144 h 菌丝的原生质体制备条件进行考察。其中三类酶 高产量的原生质体为基础。酶解法是制备原生质体 系统分别为：1.5% 的单一酶系统（溶壁酶、纤维素酶、蜗 的一种常用方法，而酶的种类、酶解条件、培养基 牛酶），1.5% 的纤维素酶和蜗牛酶的混合酶系统，2% 的溶 的成分[4]都对原生质体的释放有很大的影响。本文 壁酶系统；溶壁酶浓度：1%、1.5%、2% 、3%、4% ；培养 优化了猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色 基成分的考察：碳源种类筛选及综合培养基中添加成分的筛 及分子鉴定获得了高纯度的单核体，为进一步开展 选。将制得的原生质体稀释后涂板再生及鉴定，以选取单核 猴头菌基因组水平的研究提供材料。 菌丝。单核菌丝的鉴定方法包括：性状、显微及分子鉴定。 其中显微鉴定的观察方法包括一般显微观察和 DAPI 荧光 1 材料与方法 染色观察；分子鉴定扩增的是单核菌丝的核糖体内转录间隔 1.1 材料 区（ITS ）序列。 1.1.1 菌种 发酵的猴头菌菌丝由中国科学院微 结果 在马铃薯培养基中静置培养 72 h 的猴头菌丝，用 生物所提供，经 PDA 培养基纯化获得，并经 DNA 序列鉴定属于猴头菌。 2% 的溶壁酶液，以 0.6 mol/L KCl 为渗透压稳定剂，在 pH 5.5、温度 30 ℃ 的条件下酶解 3 h ，原生质体的释放量最 1.1.2 培养基 PDA 培养基：马铃薯 200 g ，葡 大；再生的单核体经形态及分子生物学鉴定证明是猴头菌。 萄糖 20 g ，琼脂 15 g ，水 1000 ml ，pH = 5.5 。葡 萄糖培养基：葡萄糖 20 g ，蛋白胨 2 g ，KH2PO4 结论 通过原生质体制备及再生方法获得的猴头菌的单核 3 g，MgSO ·7H O 1.5 g，水 1000 ml ，碳源筛选 菌丝可以为猴头菌活性次生代谢产物相关基因的发掘奠定 4 2 时分别以麦芽糖、蔗糖、淀粉替代培养基中的葡萄 基础。 糖。综合培养基：在葡萄糖培养基中分别加入马铃 【关键词】 猴头菌； 原生质体； 单核体； 荧光 薯、燕麦、麦麸各 200 g 。除培养基筛选实验，其 染色 余实验材料均用添