白念珠菌耐药相关蛋白Rta2p及脂筏关系的研究.pdfVIP

目 录 中文摘要…………………………………………………………………1 英文摘要…………………………………………………………………3 缩略词表…………………………………………………………………5 前言………………………………………………………………………7fjlJ舌………………．．……………………………………………………．’7 第一部分Rta2p在白念珠菌细胞的定位及RTA2基因缺失对脂筏的 影响 一、RTA2基因回复菌的构建及鉴定…………………………………．． (一)实验材料…………………………………………………………．．11 (二)实验方法…………………………………………………………．．14 (三)实验结果…………………………………………………………．．22 (四)讨 论…………………………………………………………．．26 二、RTA2基因与GFP融合菌株的构建及鉴定………………………． (一)实验材料…………………………………………………………．．27 (二)实验方法…………………………………………………………．．30 (三)实验结果…………………………………………………………．．35 (四)讨 论…………………………………………………………．．37 三、RTA2基因回复菌与Rta2p．GFP菌株表型鉴定 (一)实验材料…………………………………………………………．．38 (二)实验方法…………………………………………………………．A0 (三)实验结果…………………………………………………………．．41 四、Rta2p与脂筏关系研究 (一)实验材料…………………………………………………………．．43 (二)实验方法…………………………………………………………．．46 (三)实验结果…………………………………………………………．．50 (四)讨 论……………………………………………… 61 第二部分RTA2基因缺失与脂筏抑制剂协同抑制咪康唑发挥抗 真菌作用 一、材料与方法 (一)实验材料…………………………………………………………．．64 (二)实验方法…………………………………………………………．．65 二、实验结果……………………………………………………………67 三、讨 论……………………………………………………………73 总结……………………………………………………………………75 参考文献…………………………………………………………………76 文献综述…………………………………………………………………83 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明…………………………90 致 谢…………………………………………………………………92 白念珠茵耐药相关蛋白Rta2p与脂筏关系研究 摘要 白念珠菌(Candidaalbicans)是目前深部真菌感染最为普遍的病原菌之一，目前 治疗白念珠菌感染临床应用较多的是唑类药物，随着长期大量广泛地应用，耐药菌株 不断产生，由耐药导致的治疗失败越来越多。因此，需要我们寻找白念珠菌对唑类药 raits)也叫做去垢 物的耐药机制，为药物治疗提供依据。在白念珠菌中，脂筏(1ipid 剂不溶膜(detergent．resistant 区域，其中还包含许多具有重要功能的蛋白，在许多细胞活动中发挥重要的作用。我 们实验室前期的研究发现，在白念珠菌中，RTA2是钙调神经磷酸酶介导的唑类药物 耐药的必须基因，并且Rta2p参与了鞘脂成分一长链碱二氢鞘氨醇从细胞膜内向细胞 膜外转运。因此，我们推测Rta2p可能是通过影响脂筏发挥对唑类药物的耐药作用。 在本实验中，我们构建了Rta2p．GFP的融合表达菌，通过激光共聚焦显微镜观 察，发现Rta2p可以和脂筏的主要组成成分麦角甾醇共定位，且这种定位会被麦角甾 醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。接着我们用加入去垢剂TritonX．100的密度梯度超 速离心方法提取脂筏，利用Western blot方法考察分离的脂筏，发现Rta2p与公认的