白血病抑制因子对PVL新生大鼠星形胶质细胞增殖作用的研究.pdf

胎期星形胶质细胞从神经前体细胞发育成熟的重要囚子。鉴于LIF与少突胶质细 胞、神经元以及星形胶质细胞关系密切，明确LIF是否参与了早产儿脑损伤病变的 损伤或修复过程，将有助于早产儿脑损伤的研究。目filfLIF与新牛期脑损伤的研究 报道少见，尚不清楚LIF是否以及如何影响早产儿脑损伤后星形胶质细胞增殖。 与生后7同龄大鼠不同，尘后2～5F]龄新生人鼠少突胶质细胞发育处于晚期 少突胶质前体细胞阶段；尘后3同龄新生大鼠单侧颈总动脉结扎联合低氧模型能 够产生PVL病变，足目前国际上公认的模拟早产儿脑损伤的动物模型。因此本研 究通过建立PVL新生大鼠动物模型，研究PVL新生大鼠脑组织内源性LIF的表 达变化，通过体内外实验进一步研究外源性LIF对PVL新生大鼠星形胶质细胞增 殖的作用，并探讨其可能的机制。为早产儿脑损伤的治疗，提供理论依据。 材料和方法 一、动物模型与分组 健康清洁级3F1龄(P3)Wistar大鼠，应用随机数字表法随机分为三组：对照 组(SHAM组)，实施假手术；实验组(PVL组)，实施左侧颈总动脉结扎术联 合低氧；LIF干预组(PVL+LIF组)：在左侧颈总动脉结扎联合低氧术后1天腹腔 和PVL组分别腹腔注射同等容积的无菌生理盐水。 二、细胞模型与分组 将同批次培养传至第三代的星形胶质细胞随机分为正常培养组(N)和氧糖 剥夺培养组(OGD)；两组按LIF终浓度的不同，再分别随机分为5个不同的干预 组：LIF 1 0ng／ml组(无LIF干预组)、LIF5ng／ml组、LIF0ng／ml组、LIF30ng／ml 组、LIF 50ng／ml组，分别『F常培养和OGD培养6／j时。 三、标本的采集和处理 (一)动物标本 SHAM组和PVL组大鼠分别于缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d相应时 2 问点处死，每组16只。LIF干预组及与其对照的SHAM组和PVL组于缺氧缺血 后14d处死，每组8只。处死前乙醚吸入麻醉，局部消毒，依次打丌腹腔、横膈、 胸腔，暴露心脏，经片心窜以生理盐水灌注至流出液体清亮， (用于制作石蜡或 冰冻切片的标本继续以4％多聚甲醛灌注)，断头取脑。待做病理形态学检测和免 的标本包入无菌锡纸·I一置液氮罐内，冉转移至一80℃冰箱。 (二)细胞标本 弃培养基，PBS冲洗细胞后，用于免疫组化和免疫荧光的标本以4％多聚甲醛 固定：待做Real—time blot的标本用0．25％胰酶消化 的无菌Eppendorf管内，移至一80。C冰箱；待做Western 后离心去上清，收集沉淀于无菌-Eppendo艚内，移至一80V冰箱冻存。 四、实验方法及检测指标 1、新生大鼠脑组织HE染色检测病理形态学改变； 2、免疫组化法检测新生大鼠脑组织中GFAP和MBP蛋白的表达以及体外培 养的星形胶质细胞PCNA蛋白表达； 3、免疫荧光双标染色法检测新生大鼠脑组织中LIF和GFAP蛋白的共表达： 4、CCK一8法测定体外培养的星形胶质细胞活力； 5、EdU检测体外培养的星形胶质细胞DNA合成； 6、Real—time PCR检测新生大鼠脑组织中LIFmRNA的相对表达量；Real． time mRNA、VEGFmRNA、 PCR检测体外培养的星形胶质细胞PCNA miR20b～5p的相对表达量； blot测定体外培养的星形胶质细胞PCNA、VEGF的蛋白表达； 2000Transfection 8、应用LipofectamineTM Reagent对体外培养的星形胶质细 Transfection miRNA 胞转染siR—RiboTM Control(Cy31和miR．RiboTM 3