葡萄籽原花青素对小鼠脑缺血再灌注损伤保护作用及机制的研究.pdf

丝线分别结扎带迷走神经的两侧颈总动脉，记录小鼠存活时间。 4．小鼠脑缺血再灌注模型的复制：健康昆明种小鼠随机分为假手术组、 (2mg／kg)治疗组。小鼠乙醚麻醉，仰位固定于手术台上(温度保持在 37。C)，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉并用无损伤动脉夹夹闭30rain，然 后松开动脉夹使血流再通，即复制出脑缺血再灌注模型。术口洒青霉素粉 抗感染，无菌缝合皮肤，回笼饲养。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不夹闭。 二、各项指标检测 AOC)的测定：再灌注72小时处死小鼠，于冰盘上取脑组织，用生理盐水制 成10％的脑组织匀浆，低温离心，取上清液，按试剂盒说明书分别测定脑组 蛋白含量。 2．病理组织学检查：再灌注72h后，以10％乌拉坦(19／kg)麻醉动物， 4％多聚甲醛200ml灌 从左心室快速灌注室温生理盐水lOOml，继以4。C 注固定，迅速取脑，置4。C4％多聚甲醛中后固定12h，按常规方法制作病 理切片，HE染色，用光学显微镜对各组脑海马CAl区组织切片进行病理学 检查。 3．脑组织伊文思蓝(Evansblue，EB)含量测定：在处死小鼠前1小时经 尾静脉注射2％EB，在检测前20min进行心脏灌注，直至心房流出清亮的 液体为准。术后72h处死小鼠，摘取脑组织用电子天平精确秤其湿重后，投 入试管中，分别加入3ml甲酰胺，加盖后于45。C的水浴箱孵育48h，轻轻摇 620nm)。 4．脑皮质血流检测：小鼠用10％乌拉坦ip麻醉(19／kg)，于小鼠前囟 后、中线右侧各3mm处钻一直径为2～3mm的小孔，将激光多普勒血流仪 ．3． 手术组、缺血再灌注72小时组及相应的治疗组小鼠的脑皮质血流。 5．细胞因子含量测定： 5．1ABC—ELISA法检测细胞因子含量： IL一10的含量，检测方法按试剂盒说明书进行。 术后72小时处死小鼠，于冰盘上快速剥离脑组织，以冰冷的PBS冲洗， 滤纸吸干，立即于电子天平秤重，配成10％脑组织匀浆，匀浆液于4。C 见试剂盒说明书)在波长492mn处检测IL—lB、IL一10的含量。 5．2RT—PCR法检测脑海马组织中细胞因子及明胶酶A，BmRNA的 表达 脑组织总RNA的抽提及逆转录反应：参照RNAout说明书分别提取脑 RNA Radom9 dNTP RNaseInhibi- sample，0．5lxl mel-s，1¨l Mixture，0．25ixl AMVReverse 10×RT tot，0．5 Transerptase及1Buffer。混合物的逆转 tzl tzl RNAPCR 录反应条件是[参见TakaRa kit，(AMV)Vet3．0]：30。C10min， 50℃30 rain，99℃5rain，5℃5 列设计IL一1B、TN凡、明胶酶A，BmRNA引物。序列如下： IL一1 B；．sense5一GAGATrGAGCTGTCTGCT一3， anfisense5’一AAGGAGAACCAAGCAACGAC一3’．313 bp； TNF一Ⅱ：sense5’一CCACCATCAAGGACTCAA一3。． antisense bp； MMP一2：sense5’一CAACGATGGAGGCACGAGTG一3’， anfisense bp； MMP一9：seIlse5一CTITGAGTCCGGCAGACAAT一3， antisense bp。