生物分离工程 贾凌云 吸附层析.pptVIP

Before use the medium is loaded with a solution of divalent metal ions such as Ni2+, Zn2+,Cu2+, Ca2+, Co2+ or Fe2+. The binding reaction with the target protein is pH dependent and bound sample is, most commonly, eluted by reducing the pH and increasing the ionic strength of the buffer or by including EDTA or imidazole in the buffer. Metal chelate affinity chromatography is excellent for purifying recombinant (His)6 fusion proteins. * * * * * * 分离中起决定作用是载体上的活性基团?配基 特异性配基：吸附的专一性强，只对特定的分子产生吸附 作用。如抗体、抗原，酶、底物等 ；由于 每一新的分离对象要求不同的配基，一般好 的配基仍然要依靠实验。 通用性配基：对一类物质产生吸附作用。 金属螯合配基：金属螯合亲和色谱法(MCAC)又称固定金属 亲和色谱法(IMAC)。此法是将金属离子固 定在载体上,利用金属离子与蛋白质表面 组氨酸等的配位作用进行分离,因此可以 选择性地分离对金属离子有亲和力的蛋白 质。 6．染料 染料作为亲合色谱的配位体最典型的是发色团 CibacronBlue F3G—A与琼脂糖或其它基质偶联后，能对 多种酶和蛋白质显示出亲合性。吸附的蛋白质能用特殊 的方法洗脱。这种吸附剂可与激酶、脱氢酶、糖酵解酶 和许多血液蛋白质有效地结合。 载 体 载体的控制因素： 蛋白质最初进入配位体范围的大小； 基质骨架对配位体微环境的影响。 理想载体（基质）应具备以下的性质： (1)基质的结构应是松散的多孔网络，以便大分子均匀地不受阻碍地进出。多孔性对良好的流动性和大分子的渗入是必要的，而基质的渗透性决定了能为大分子自由利用的配位体浓度(基质的排阻效应应尽可能小)。 (2)基质的颗粒应是均匀的球形，刚性较强，容易使扩散速率低的物质，如蛋白质达到扩散平衡，一定的机械硬度才能保证液体通过色谱床时，在静压作用下不致变形，使蛋白质分离而不受影响。 (3)基质的物理和化学性质必须稳定，不会因配位体共价偶联以及互补大分子吸附、洗脱时条件的变化而发生变化；同时也能经受起制备和处理过程中的pH及温度的影响，特别是要能抗长期反复使用过程中细菌的腐蚀作用。 (4)基质的化学性质应是惰性。基质的骨架与蛋白质或其它重要生化物质的反应必须很弱，以降低非特异性的吸附作用。基质的骨架即便与蛋白质或酶的反应非常弱，也足以引起蛋白质或酶的变性。产率自然会因此而降低。 (5)功能化是亲合色谱中基质最重要的特征之一。在不损害基质结构的条件下，功能基可与各种配位体共价结合。丰富的功能基能偶联比较多的配位体，以使那些对配位体亲合力低的蛋白质不产生较强的保留，达到较为理想的分离。 具有实用价值的基质 理想的亲合色谱的基质不大容易得到，大多数是仅适 用于某些特殊的应用。具有实用价值的基质，一般是纤 维素、琼脂糖、交联葡萄糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺 凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶和多孔玻璃和陶瓷等， 这些均有商品出售，读者可根据自己研究工作的需要， 参考有关文献选择。 间 隔 臂 如何提高固定化配基的空间效应，即减少配基与受体 结合的空间阻力？在基质表面与配基间加入一定长度的 间隔臂是一有效方式。 间隔臂长与间隔臂的性质很重要。 间隔臂长：取决于配基与受体的分子大小，一般处于6-18 个原子间。 间隔臂的性质：间隔臂大多数是线型的脂肪族碳氢化合 物，其首、末端具有能与基质和配位体 连接的功能基。疏水性间隔分子的存在 容易产生非特异性的吸附作用，而亲水 性的间隔分子却能极大地降低非生物特 异性的吸附作用。