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几类PCR新技术的介绍 河南环球仪器设备有限公司 张胜利 河南环球仪器设备有限公司 1 几类PCR新技术的介绍 1.热启动PCR 2.Touch-down PCR 3.RT-PCR 4.兼并引物PCR （Degenerate Primer ） 5.巢氏PCR （Nested PCR ） 6.反向PCR （Inverse PCR ） 7.不对称PCR （Asymmetric PCR ） 8.原位PCR 9.重组PCR 10.多重PCR 河南环球仪器设备有限公司 2 几类PCR新技术的介绍 11.免疫-PCR(immuno-PCR) 12. 甲基化特异PCR(MSP) 13.标记PCR和彩色PCR 14.连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR) 15. cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE ） 16. AFLP （扩增性片段长度多态性） 17. 依赖核酸序列的扩增 18. 转录依赖的扩增系统 19.定量PCR 河南环球仪器设备有限公司 3 热启动PCR 1.概述：尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚 合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制 过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温 度时会产生非特异性的产物。 热启动就是PCR仪达到变性温度再加入Taq DNA聚 合酶，从而抑制一种基本成分延迟DNA合成。 2.应用：如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的 遗传元件的构建和操作 3.使用条件：好的引物设计， 4.优缺点：⑴优点：提高PCR特异性最重要 ⑵缺点：方法十分烦琐，尤其是高通量应用。 河南环球仪器设备有限公司 4 Touch-down PCR 1. 定义：又称降落PCR. 即选定一个温度范围，如50-35℃， 每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循 环。 2.原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性 条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非 特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先 被扩增。 3.选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的 Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度。 4.应用范围： ⑴low copy of targeted DNA; ⑵RT-PCR using oligo-dT; ⑶high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers. 河南环球仪器设备有限公司 5 RT-PCR 1.定义：是以RNA为模板，联合逆转录反应 （reverse transcription ，RT ）与PCR ，可用于检 测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA 模板。RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的 介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补 cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另 一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生 成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。 河南环球仪器设备有限公司 6 RT-PCR 2.检测方法 ⑴一步法：利用同一缓冲