单增李斯特菌检测技术2012.pdf

单增李斯特菌检测技术 广东省CDC赖蔚苳 2012.3.28 李斯特菌属 最新的分类学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ） 伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）  单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛 存在于自然界中。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳 制品、蔬菜等都可被污染。该菌在4℃的环境中仍 可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原 菌之一。  其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷 人群。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为 每一百万人2-15例，死亡率为13-34%  加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。 形态与染色  革兰氏阳性小杆菌，长0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈V 字形，成对 排列。  无芽胞，一般不形成荚膜。  22~25 ℃环境中形成4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。 培养特性  需氧或兼性厌氧，营养要求不高；  在22 ℃~25 ℃培养有动力，穿刺培养2~5 天可见 倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗 运动。  生长温度：2 ℃~42 ℃，最适培养温度为35 ℃~37 ℃。  pH 范围：pH 4.0 ~pH 9.0 ，最适宜生长pH 5.5 按2012食源性致病菌监测工作手册  定性检测  定量检测 定性检测  增菌培养:LB1增菌液225 mL，于30℃培养 24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中 二次增菌。  分离培养:LB2 二次增菌液转种于选择培养基 PALCAM和科玛嘉琼脂平板上，于37℃培养 24 h，观察各个平板上生长的菌落, 。 各个平板上的菌落特征见表 MMA PALCAM OXA CHROMagar 30℃48h菌 37℃24h－ 30℃24h－ 37℃18h- 落针尖大小、 48h，2mm灰 48h,2mm灰 24h,蓝色菌 形态不典型， 绿色中心黑色 黑色菌落周围 落周围呈白 与杂菌难区 凹陷，菌落周 呈棕黑色水解 色晕圈 分抑制性强 围呈棕黑色水 圈 解圈 MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难与 杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与杂 菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差 L.M在PALCAM培养基生长特征 L.M在OXA培养基生长特征 单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态 染色镜检  将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4 ～ 0.5μm×0.5 ～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。  该菌为革兰氏阳性无芽孢杆菌，在纯培养物中呈短 小杆菌，在初龄培养物中呈球杆菌状，在老龄培养 物中呈长丝的长杆菌状，有些细菌因此而变成革兰 氏阴性；为需氧或兼性厌氧菌，在20 ～25℃培养时 能形成4根鞭毛，运动活泼；在37℃培养时无鞭毛， 运动消失。