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370儿童支原体肺炎实验室检测探究 　 作者：陈建伟 陈卫宇 胡秀华 屠秀菊 陈国英 夏金伟 【关键词】 儿童 支原体肺炎 实验室检测 肺炎支原体（MP）是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多样性、能通过除菌滤器、在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物，是引起呼吸道感染的一种病原体。本院儿童支原体肺炎实验室检测研究工作于2005年开始,经过2年多的研究和工作，课题组积累了大量的实验数据和分析资料，现报告如下。 1 标本和仪器 1.1 标本来源 2006年10月至2008年10月，本院门诊和住院的0.5～13周岁患儿387例，均以咳嗽症状为主。用无菌棉拭子直接擦拭咽后壁、扁桃体、假膜边缘或口腔溃疡处，用以培养和聚合酶链反应（PCR）检测；呼吸道感染4d以上病例静脉采血，用以血清学试验。 1.2 试剂与仪器 应用罗氏（Lightcycle）实时荧光PCR仪测定MP—DNA，MP—PCR试剂盒为中山达安公司产品；应用芬兰Thermo Labsystems酶标洗板机测定MP—IgM，试剂为上海华泰生物工程公司；明胶颗粒凝集法试剂为日本富士瑞必欧株式会社生产；培养基科室自配；基因测序委托杭州市迪安医学检验中心。 2 检测方法 2.1 实时荧光PCR法 操作按规范标准严格执行，以F：5′CCAACCAAACAACAACGTTCA-3′，R：5′ACCTTGACTGGAGGCCGTTA-3′为引物，引物位于P1基因区。 2.2 ELISA法 严格按照说明书操作。 2.3 基因测序 ABI3130基因分析仪，采用Big Dye Terminator Sequencing Standardv3.1,3130POP-7TM Polymer,使用StdSeq50-POP-7分析模式。 2.4 培养法 以牛心消化液为基础另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体和固体培养基，在液体培养基中加入葡萄糖以及酚红、美兰指示剂，将标本接种于液体培养基中增菌，在1周后培养基由紫变绿，液体清晰，可转种于固体培养基上，在5% CO2大气环境下培养10～20d，如阳性再进行生化鉴定。 2.5 明胶颗粒凝集法 被动凝集法,用肺炎支原体(Mac株)抗原致敏的明胶颗粒与一定比例稀释的血清做凝集反应,用未致敏的明胶颗粒做对照反应,以观察被检测血清的凝集效价,当凝集效价gt;1∶40时判断为阳性。 3 结果 3.1 检测结果 387例患儿中，PCR检测，阳性52例，阳性率13.4%，阳性标本大多集中分布在2～9岁；ELISA法检测，抗MP—IgM阳性36例，阳性率9.3%,多分布在5～12岁，随着年龄增大标本阳性率增高；明胶颗粒凝集法检测，阳性33例，阳性率8.5%。PCR检测阳性的52例患儿标本做培养，培养阳性12例，阳性率23%。见表1。表1 实验检测结果及年龄 3.2 PCR与其它方法比较 见表2。 表2 不同检测方法与PCR比较 3.3 基因测序 从52例PCR法阳性标本中随机选取15例标本做基因测序,其标本中存在着MP-DNA特异序列：TTACAATCTTAAAGACCTTCATCGTCT—CATGCGGCATTGCTCCATCAAGCTTTCGCTCATTGTGAAAAATTC 4 讨论 从表1可以看出上呼吸道感染的儿童中MP的检出阳性率PCR方法最高，达到13.4%,ELISA法与明胶颗粒凝集法检测阳性率较接近，分别为9.3%和8.5%,而培养法在PCR检测阳性的52例患儿中检出12例阳性,30例PCR法阴性患儿均为阴性,培养法的阳性检出率明显低于以往的文献报道。 　 以PCR阳性作为肺炎支原体肺炎的诊断标准，从表2中可以看出，52例PCR法阳性标本培养法阳性12例（占23%），培养法阳性率明显低于PCR检测阳性率。考虑这主要是PCR检测的是MP-DNA，不管MP是否存活只要有微量（60基因拷贝）就可以检测到，而培养法要考虑MP的存活性及足够的数量，以及有否使用过抗生素，故PCR在敏感度上高于培养法。支原体是体外培养中最小的病原微生物，且培养法复杂、周期较长，故作者认为，PCR检测明显优于培养法。 52例PCR检测MP-DNA阳性患儿中，ELISA法检测抗MP-IgM阳性28例（占53.8%）,余24例阴性(占46.2%),抗MP-IgM阳性率明显低于PCR检测的MP-DNA阳性率。因为儿童特别是婴幼儿，由于免疫功能尚未发育完全，抗MP-IgM生成不足以影响检测结果，这与抗MP-IgM多分布在6～11岁年龄较大儿童的结果相符。在335例PCR检测阴性的非肺炎支原体感染患儿中检出8例抗MP-IgM阳性，假阳性率为2.4%,实验证实PCR在特异性与敏感性方面优于ELISA法。 在PCR检测阳性而培养阴性的40例患儿中有12例EL