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GFP作为报道基因在探究WT1基因调控元件中应用 　 作者：胡绍燕　陈子兴，赵晔，傅铮铮，何军，岑建农，谷敏 【摘要】 　　本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP1载体中，转化感受态E.coli菌细胞，筛选了阳性转化菌落，通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落，抽提重组质粒DNA；同时将重组质粒转染K562细胞，通过荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明： 通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体（pEWP）和含有WT1基因启动子和增强子的载体（pEWPE、pEWPA 和pEWPD）。转染48小时后，pEWP、pEWPE、pEWPA 和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光，而转染了空载体pEGFP1的K562细胞未出现荧光。结论： EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究，为进一步开展基因治疗创造了条件。 【关键词】 EGFP； WT1基因；启动子；增强子；K562细胞 　　Application of EGFP as Reporter Gene in Study of WT1 Regulation Elements Abstract In order to investigate the feasibility of using EGFP as a reporter gene in WT1 transcriptional regulation study. WT1 promoter and enhancer were ligated into the vector pEGFP1 by recombinant DNA technique and confirmed by restriction enzymes digestion. The resultant constructs were transfected into K562 cell line by DMRIEC reagent and the function of these WT1 gene elements was detected by using a fluorescent microscope after transfection for 48 hours. The results indicated that the recombinant vectors, pEWP containing WT1 promoter, and pEWPE, pEWPA and pEWPD harboring both WT1 enhancer and promoter, had been successfully constructed. Fluorescence was observed in K562 cells transfected by pEWP, pEWPE, pEWPA and pEWPD, while no fluorescence could be detected in cells transfected by pEGFP1. It is concluded that EGFP gene as a reporter gene can be applied to the WT1 transcriptional regulation study, which provides the basis for gene therapy. Key words EGFP; Wilms′ tumor gene; promoter; enhancer; K562 cell WT1基因是一个参与转录调控的双相调节子，它与各种造血调控因子相互作用，在白血病发病过程中起重要作用。近十几年的研究证实，80％-90％的急性白血病中WT1基因高表达［1，2］，且随着病情的进展表达增高，被认为是一种“泛白血病”标志［3］，有可能成为白血病基因治疗和特异性免疫治疗的新靶点。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因及其载体是近年来研究活细胞中基因表达和蛋白定位的新型报道基因，已成功表达于多种原核生物和真核生物［4］。 本研究将WT1基因启动子、增强子片段连接到携带突变型绿色荧光蛋白报道基因而自身无启动子、增强子的载体pEGFP1中，通过检测瞬时转染后K562细胞的荧光强度以确定重组载体用于研究WT1基因转录调控功能的可行性，进而为研究WT1启动子和增强子用于白血病的基因治疗奠定基础。 材料和方法 主要材料 携带WT1启动子和增强子的质粒pCB.7e250（-）由美