中药黄芪对球囊损伤大鼠颈总动脉后增殖细胞核抗原及细胞周期蛋白.docVIP

中药黄芪对球囊损伤大鼠颈总动脉后增殖细胞核抗原及细胞周期蛋白 　【关键词】 黄芪；,,球囊损伤；,,大鼠；,,增殖细胞核抗原；,,细胞周期蛋白依赖性激酶；,,免疫组织化学方法 　　摘要： 目的：观察黄芪对球囊损伤大鼠颈总动脉内皮后对其细胞核增殖抗原（PCNA）及细胞周期蛋白依赖性激酶（cdks, cdk2，cdk4）表达的影响，探讨其可能机制。方法：随机将36只雄性SD大鼠分为对照组、手术组及黄芪组，球囊损伤大鼠颈总动脉前1天始给对照组和手术组0.8ml/100g/d生理盐水灌胃，黄芪组给予相同剂量的中药灌胃，连续至第5天和28天两个时间点处死大鼠，取其损伤的颈总动脉，应用组织学检查术后5天和28天的内膜增生情况和免疫组织化学方法检测5天时PCNA、CDK2、CDK4蛋白的表达。结果：球囊损伤颈总动脉术后5天时，血管内膜及内膜面积轻度增生，无统计学意义；28天时，手术组内膜增生明显，用中药黄芪后增生减少，与手术组比较差异有显著性(Plt;0.05) ，用黄芪后内膜增生面积减少，与手术组比较差异有显著性(Plt;0.05)。用免疫组织化学方法测术后5天各组PCNA、CDK2、CDK4蛋白阳性细胞的表达，手术组表达最强，用药后各组表达量均显著减少(Plt;0.01)。结论：中药黄芪对球囊损伤后动脉血管内膜增生有抑制作用，其机制可能与下调细胞核增殖抗原及细胞周期蛋白依赖激酶的表达，从而抑制血管内膜平滑肌细胞的增殖有关。 　　关键词： 黄芪； 球囊损伤； 大鼠； 增殖细胞核抗原； 细胞周期蛋白依赖性激酶； 免疫组织化学方法 　　经皮腔内冠状动脉成形术（percutaneous stransluminal coronary angioplasty， PTCA）已经成为冠心病治疗的主要选择，但术后再狭窄率高，是PTCA远期疗效的主要限制因素［1］。其主要机制是血管平滑肌细胞增殖及迁移，细胞外基质合成，血小板大量聚集，局部血栓形成，早期的血管回缩和晚期的血管重构［2］，其中血管平滑肌的增殖和迁移最为重要［3］。中医认为本病属于血淤症的范畴，基本病机是本虚标实、气虚血瘀，故治疗以益气活血为主。本研究应用球囊损伤大鼠颈总动脉内皮复制动脉狭窄的模型，给予中药黄芪治疗，观察其对大鼠颈总动脉血管内膜增生过程以及对PCNA、CDK2、CDK4蛋白表达的影响，探讨中药黄芪防治冠脉内血管成形术后再狭窄的可能机制。 　　1 材料和方法 　　11 实验动物 　　雄性SD大鼠36只，清洁级，体重350~450g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。 　　12 实验药物 　　中药黄芪由黄芪50g加适量水煎煮两次，高温消毒，药液浓缩后制成浓度为0.5g/ml的汤药。 　　13 实验方法 　　131 动物造模 动物随机分为对照组、手术组及黄芪组,每组两个时相点（5天和28天），每个时相点6只动物。造模：3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，由右侧股动脉插入2F球囊导管，沿股动脉、髂动脉、腹主动脉、主动脉弓至左侧颈内外动脉分叉处以颈部暴露切口确认颈总动脉，球囊充盈生理盐水（0.2ml）后导管移行约1.5cm造成颈动脉过度扩张损伤，负压回抽生理盐水，然后再送入导管，反复抽拉3次，以使内膜剥脱，术后连续3天肌注青霉素预防感染。造模前一天，黄芪组开始灌胃给药，0.8ml/100g/d,连续治疗5天到28天时处死，手术组及对照组给予等量生理盐水灌胃。 　　132 形态学观察 各时间点处死大鼠后，取出球囊损伤的左颈总动脉约1.0cm，4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察血管内膜增生情况，并用图像分析仪（HMIAS2000型全自动彩色图像分析系统）测定内膜增生厚度及面积。 　　133 免疫组织化学法 将损伤的大鼠颈总动脉石蜡包埋，常规切片,厚度为2μm，对5天时相点的各组进行PCNA、CDK2、CDK4蛋白的免疫组织化学检测，SP法，DAB H2O2显色，苏木素复染，胞核呈棕黄，黄色为阳性。PCNA、CDK2、CDK4抗体及SP试剂盒、DAB显色试剂盒均为美国Santa Cruze公司产品，购自北京中杉金桥公司。每例动物每个指标观察3张切片，每张切片随机取5个不重叠的高倍镜视野（×400倍），显微镜下记取每张切片阳性细胞的百分率，取其均数，作为阳性表达指数来表示蛋白质的表达水平。 　　14 统计学分析 　　数据统计采用SPSS12.0软件包，各组数据用x±s表示，各组间比较用方差分析，两组间比较用t检验。 　　　2 结果 　　21 形态学观察 　　球囊损伤术后5天，对照组没有内膜增生，其余两组可见极少内膜轻度增生，无统计学差异；术后28天，手术组管腔明显狭窄，内膜显著增生，平滑肌细胞排列紊乱，胞核呈圆形及椭圆形。图像分析显示术后28天时黄芪组新生内膜增生厚度和面