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大肠癌患者外周血微转移及化疗及预后关系 　【摘要】 ［目的］ 研究大肠癌患者外周血微转移与化疗及预后的关系。［方法］ 选取大肠癌患者121例，应用RT-PCR技术，以CK20 mRNA为标志物，检测术前、术后第2天、首次化疗后血液微转移情况及与生存期的关系。［结果］ 术前血液CK20 mRNA微转移阳性率为53.7%，其中DukesA、B、C、D期的阳性率分别为20%、25%、78.5% 、75%, 4组之间有显著性差异(χ2=12.03，Plt;0.05)。术后第2天血液CK20 mRNA微转移阳性率为59.5%,手术前后阳性率无显著性差异(χ2=0.82，Pgt;0.05)。化疗前后血液CK20 mRNA阳性率差异非常显著(χ2=25.59，Plt;0.05)。Cox模型分析提示CK20 mRNA阳性表达者及化疗无效者预后不佳(Plt;0.05)。［结论］ 化疗能降低大肠癌患者血液微转移的发生率；血液微转移提示患者预后不良。 【关键词】 大肠肿瘤 大肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一。大肠癌患者中肿瘤的浸润和转移是肿瘤治疗后失败以及影响预后的主要原因。因此，在大肠癌患者中检测出肿瘤早期微转移的指标,对指导临床、改善大肠癌患者的预后具有重要意义。本研究通过RT-PCR方法检测大肠癌患者血液CK20 mRNA表达，研究其手术前后及化疗前后血液中微转移变化，并探讨大肠癌血液微转移与手术和术后化疗的影响及预后的关系。 1 材料与方法 1.1 研究对象 随机选择2000年1月~2001年12月黑龙江省医院手术切除的大肠癌（组织学类型为腺癌）121例。其中男性69例，女性52例，年龄35~79岁，平均59.44±9.40岁。所有病人术前均未接受化疗、放疗及其它辅助治疗。其中高分化腺癌38例，中分化腺癌62例，低或未分化腺癌21例。Dukes分期：A期25例、B期28例、C期56例、D期12例。标本采集时机为：术前、术后第2天、术后第1个疗程化疗结束后当天(术后化疗均在术后第15天开始进行，方案为FOLFOX4方案：氟尿嘧啶、奥沙利铂、亚叶酸钙)。取血部位为对侧上肢浅静脉，弃去注射器抽取的前5ml血，以减少标本被皮肤细胞污染可能。 1.2 CK20 mRNA的检测 1.2.1 引物设计 CK20 mRNA引物参考相关文献，由生工公司合成，上下游引物序列分别为：5′-CCTCTGACGTCCATCATCTC-3′，5′-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3′，预期产物DNA为462bp。同时以β-actin为内参照，其引物来自鼎国公司RT-PCR试剂盒，其预期产物DNA为540bp。 1.2.2 RNA提取 在标本获得后6h内进行，对血液标本以密度梯度离心法进行单个核细胞分离，以Tripure提取得到的单个核细胞RNA，分光光度计检测获得RNA样本D值，确定样本A260/A280gt;1.65，排除RNA酶污染可能。行RN电泳，见清晰的18S、28S两条带，证实RNA无降解，可为RT-PCR反应模板。 1.2.3 RT-PCR反应 使用Promega Access RT-PCRSystem试剂盒，反应体系25μl，参照试剂盒说明行一步法CK20 mRNA RT-PCR扩增，同时每组体系均设立β-actin为内参照。反应条件如下：48℃ 45min，94℃ 2min，进入PCR循环，94℃30s 60℃1min、68℃2min，共40个循环，68℃7min终延长，4℃保存。 1.2.4 产物鉴定 取反应产物5μl，行电泳。电泳条件：1×TBE缓冲液，2%琼脂糖凝胶，电压5V/cm，时间30min～40min。凝胶成像系统观察，如在540bp处出现清晰条带者可证实RNA无降解和反应体系适当。如反应产物在462bp处出现清晰条带者为待测标本CK20 mRNA阳性，无此条带者为阴性。 2 结 果 大肠癌患者血液CK20 mRNA阳性率为53.70%(65/121)。其中DukesA、B、C、D期的阳性率分别为20.0%(5/25)、25.0%(7/28)、78.52%(44/56)、75.0%(9/12)。DukesA、B、C、D期之间CK20 mRNA差异有显著性(χ2=12.03，Plt;0.05)。大肠癌术后第2天血液CK20 mRNA阳性率为59.5%(72/121)，其中DukesA、B、C、D期的阳性率分别为24.0%(6/25)、28.57%(8/28)、85.71%(48/56)、83.33%(10/12)，均较术前为高，但统计学分析，手术前后血液CK20 mRNA阳性率差异无显著性(χ2=0.82，Pgt;0.05)。大肠癌术后首次化疗结束当天血液CK20 mRNA阳性率为26.7%(33