乳酸恩诺沙星对温和气单胞菌的体外药用效果研究.docVIP

　　乳酸恩诺沙星对温和气单胞菌的体外药用效果研究 　　温和气单胞菌(A.sobria)是我国淡水和海水水产品的一种常见致病菌,可以引起多种水产养殖动物感染发病,可单独引发感染或与嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)及其他病原菌混合感染,具有发病率高、传染性强、死亡快的特点。有报道该菌可导致罗非鱼(Tilapia)的出血性败血病,中华鳖(Trionyx sinensis)的肝水肿病,鲤((Cyprinus carpio)的体表溃烂病,幼鳖的白点病[1]等。另外,此菌可以通过病鱼经消化道感染人类,导致人类食物中毒,造成腹泻、败血症等疾病[2],属于人兽鱼共染的病原细菌。 　　恩诺沙星(enrofloxacin)是第一个畜禽专用的氟喹诺酮类广谱抗菌药物[3]。广泛应用于包括水生动物在内的各种动物细菌性疾病的预防和治疗,几乎对水生动物所有病原菌均具有较强的抗菌活性,对赤鳍病、烂尾病、烂鳃病、肠炎病等水产类动物疾病具有良好的疗效[4]。乳酸恩诺沙星为恩诺沙星的乳酸盐,其水溶性好于盐酸恩诺沙星,口服吸收快,体内分布广,对革兰阴性菌有很强的杀灭作用,对革兰阳性菌也有良好的抗菌作用。为了解乳酸恩诺沙星的体外抗菌活性,达到有效的控制鱼类细菌性疾病,本研究选择鱼类病原菌A.sobria,测定了乳酸恩诺沙星对A.sobria的最小抑菌浓度(minimal inhib-itory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(minimumbactericidal concentration,MBC)和 抗 菌 后 效 应(post antibiotic effect,PAE),以期为指导生产上科学使用氟喹诺酮类药物提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1试验菌株供试A.sobria由河南师范大学水产学院水产动物医学研究室提供,分离自患病斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)。 　　1.1.2试验药品供试药品乳酸恩诺沙星(含量98%)为浙江朗博药业有限公司产品;试验所用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、琼脂粉等为北京奥博星公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1乳 酸 恩 诺 沙 星 母 液 的 制 备精 密 称 取20.0mg乳酸恩诺沙星,加入少量0.1mol/L NaOH溶液,待 完 全 溶 解 后,加 水 定 容 至10 mL,即 为2 000mu;g/mL的母液,经0.22mu;m的微孔滤膜过滤除菌后分装,使用前配制。 　　1.2.2培养基的配制TSB培养基的配制方法:称取胰蛋白胨15.0g,大豆蛋白胨5.0g,氯化钠5.0g,加适量水后,调节pH至7.2,加水定容至1 000mL,121℃高压灭菌20min;TSA培养基则是在TSB培养基中加入15g/L的琼脂粉配制而成。 　　1.2.3细菌培养将保存的A.sobria菌种进行活化,取10mu;L菌液接种到1 000mu;L的TSB培养基中,28 ℃摇床培养过夜后,划线接种于TSA培养基,28 ℃培 养24h。挑 取 典 型 的 单 菌 落 接 种 于1 000mu;L TSB培养基,28 ℃培养12h后转接到100mL TSB培养基扩大培养,调整菌液浓度使活菌数达到108CFU/mL作为后续试验用菌悬液。 　　1.2.4最 小 抑 菌 浓 度 (MIC)和 最 小 杀 菌 浓 度(MBC)测定使用杭州天和微生物试剂有限公司生产的恩诺沙星药敏纸片,采用K-B纸片琼脂扩散法,以大肠埃希菌ATCC 25922为质控,按照CLSI标准方法进行药敏试验及结果判定[5]。在药物敏感定性检测的基础上,参考戴自英等试管二倍稀释法[6-8]进行MIC的测定。将乳酸恩诺沙星药物母液稀释2倍(1 000mu;g/mL)之后加入到第1支试管,再进行2倍稀释加入到第2支试管,以此类推直至稀释到1 000mu;g/mL~0.25mu;g/mL的13个浓度梯度。 　　取15支无菌带塞试管分别编号1号~15号,每支试管装有TSB培养基4.0mL,1号~13号试管加入不同浓度的药液0.5mL,14号试管加0.5mL无菌水,15号试管加1mL的TSB培养基,将1号~14号试管各加入0.5mL浓度为108CFU/mL的菌液,使细菌的终浓度约为107CFU/mL,而培养基中的药 液 浓 度 达 到100mu;g/mL~0.025mu;g/mL,28℃恒温培养24h,观察无明显细菌生长的试管对应的最低药物浓度即为MIC。培养48h,取MIC上无明显细菌生长的各个药液浓度的菌液0.1mL均匀涂布于TSA培养基,28℃恒温培养24h,菌落数小于5个的作为该药物的最小杀菌浓度(MBC)[6],测定重复5次。 　　1.2.5乳酸恩诺沙星对A.sobria