探讨GnIH参与母猪生殖调控的可能机制.docVIP

　　探讨GnIH参与母猪生殖调控的可能机制 　　0 、引言 　　【研究意义】促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是 Tsutsui 等于 2000 年在鹌鹑下丘脑内分离到的一种神经肽，哺乳动物的类似物为 RF 酰胺相关肽（RFRP）。具有抑制促性腺激素分泌和影响性行为、摄食、生长激素分泌等作用。猪作为中国重要的家畜之一，繁殖能力是决定其养殖经济效益的主要因子。因此，研究 GnIH/ RFRP对母猪生殖调控的机理具有重要的理论意义和经济价值。【前人研究进展】国内外已对鸟类、鱼类、两栖类及人、鼠、猴、牛、羊等的 GnIH 及其受体的基因克隆、分布定位和生理功能做了大量研究。已有研究显示，GnIH/RFRP 通过其受体发挥作用，其特异性受体为 GPR147，为具有 7 次跨膜结构域的 G 蛋白耦联受体（GPCR）。关于 GnIH 分布的研究，主要集中在脑部，GnIH 在外周分布的研究相对较少。有报道显示GnIH mRNA 除在中枢神经系统有表达外，在眼、卵巢、睾丸、脾、肾等外周组织中也有表达。除了下丘脑和垂体，GnIH 及其受体已被证实在许多鸟类的性腺中分布，并通过旁分泌或自分泌的形式参与生殖调控[10]。 　　此外，GnRH 和 GnIH 的信号通路存在相互作用[11-12]。 　　【本研究切入点】目前，有关 GnIH 对哺乳动物生殖功能调控的研究较少，且尚未见对猪的研究报道。【拟解决的关键问题】本文对GnIH mRNA 在母猪体内的表达模式，不同剂量 GnIH 对卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌和增殖相关蛋白表达的影响，以及GPR147 与GnRH 的形态学关系进行了研究，从分子和蛋白水平入手，旨在探讨 GnIH 参与母猪生殖调控的可能机制，为全面而深入地研究GnIH 生理功能提供理论基础。 　　1、 材料与方法 　　试验于 2010 年 10 月至 2012 年 11 月，在南京农业大学农业部动物生理生化重点实验室及南京农业大学动物科技学院实验中心完成。 　　1.1 试验动物及材料 　　30 日龄健康苏钟仔母猪 7 头，体重为（10plusmn;2）kg，购自江苏省农科院苏钟种猪场。试验动物经颈总动脉放血处死，4 头动物立刻取其延髓、脑桥、中脑、大脑、小脑、下丘脑、海马、嗅球、脊髓、垂体、心、脾、肾、肾上腺、胃、眼球、卵巢、子宫、肝、肠（十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）、腰大肌、胆囊和膀胱，迅速投入液氮冷冻，然后转入-70℃冻存，用于GnIH 表达研究。3 头动物取其下丘脑，按照文献[13]的方法固定下丘脑和制作脑片，用于GnRH和GPR147定位研究。 　　卵巢样品采自 36 头三元杂交长白青年母猪，体重（90plusmn;5）kg，均来自江苏省天环食品有限公司。宰杀后，打开腹腔取出两侧卵巢。按照文献[14]的方法分离培养卵巢颗粒细胞。6 孔细胞板中加入 1106个/mL 的卵巢颗粒细胞悬液，37℃静置培养 72 h 后，弃去培养液，加入 10-6、10-8、10-10和 10-12molL-1GnIH 静置培养 24 h 后，收集上清，-20℃保存，用于放射免疫法检测 E2和 P4的浓度；处理后的卵巢颗粒细胞用蛋白裂解液裂解后，收集于 EP 管，-20℃保存用于 -MLV）、RNA 酶抑制剂（RNase inhibitor）、dNTPs、寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo d（t）18）、rTaq DNA 聚合酶、SYBR PremixEx Taq Kit 购自 Takara 公司；DMEM/F12、D-Hanks、胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素购自南京维森特生物有限公司；40%Acr-Bis（39﹕1）、TEMED、丽春红染色液、aceuticals，USA；羊抗 GnRH，cyclin B1，PA 和 beta;-actin，购自 SANTA CRUZ，USA；驴抗山羊罗丹明（TRITC）标记的荧光二抗和驴抗兔异硫氢酸荧光黄标记的荧光二抗（FITC）（Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.， 7300 实时荧光定量 PCR 仪为美国 ABI公司产品；制胶器、垂直电泳槽、半干转印仪为美国Bio-red 公司产品；激光共聚焦显微镜为德国 zeiss 产品。 　　1.3 试验方法及步骤 　　1.3.1 半定量 RT-PCR 母猪 24 个组织的总 RNA 提取按照 Trizol 试剂说明书在无 RNA 酶的环境下进行。 　　提取的 RNA 进行均一性和完整性检测。RNA 在无RNA 酶的环境下按两步法进行逆转录。以 GAPDH 为cDNA 合成及 PCR 内源性参照，用混合样品（取各待测样品 cDNA 等量混合）作为模版，分别对 P