抗体药物活性评价的传统方法和前沿技术.docVIP

　　抗体药物活性评价的传统方法和前沿技术 　　单克隆抗体作为治疗药物始于上世纪 80 年代初，因其具有高度的特异性、有效性和安全性的特点，在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染和器官移植排斥等多种疾病中取得了较好的治疗效果，现已成为推动全球生物产业发展的引擎。截至 2014 年 11 月，已有 50 个抗体类药物上市。2013 年全球销售排名前十位的处方药中有 6 个为抗体类药物，分别是 Humira、Remicade、Mabthera、Enbrel、Avastin 和 Herceptin,单品种销售额均超过 50 亿美元[1].抗体药物的接连上市和重磅销售引发国内外抗体类生物治疗药物的研发热潮。完善的质控标准是抗体类药物批准上市的必要条件，面对抗体类药物的快速发展，迫切需要建立相应的抗体药物质量评价技术体系，而活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。抗体与其特异的靶点结合后，通过细胞因子信号的阻断、补体系统的活化、细胞杀伤等生物学作用发挥重组抗体的治疗作用，其生物学活性测定主要是在体外建立相应的细胞评价模型，模拟其作用机制，产生客观的全程量效反应，并通过与活性标准品的比较对其生物学活性进行评价[2].近年来，转基因细胞技术和一些新技术也被应用于抗体类药物的生物学活性测定。本文将对应用于抗体药物活性评价的传统方法和前沿技术进行简要介绍，为新型抗体药物活性方法的建立提供新的思路。 　　1 基于细胞的生物活性测定方法 　　随着药物高通量筛选平台的建立和生产规模的扩大，以及对 3R（ Reduction,Refinement,Replacement） 原则理解的不断深化，人们越来越多地寻求动物实验替代方法。而基于细胞系的体外生物活性分析方法由于其高通量、高效率、高精确度等优势，越来越受到研究者和生产企业的青睐。单克隆抗体药物的作用靶点分为细胞因子及其受体、肿瘤细胞表面抗原、CD 分子、病原微生物及其产物、以及其他靶点，根据抗体药物作用的特点，目前主要有以下几类基于细胞的测活方法。 　　1. 1 细胞增殖抑制法 　　针对生长因子靶点的抗体药物多是采用细胞增殖抑制的方法来反映抗体的生物学活性，包括抗血管内皮生长因子（ vascular endothelial groan epidermal groal groan umbilical vein endothelial cell,HUVEC）增殖抑制法，即在刺激因子 VEGF 存在的情况下，抗VEGF 单抗能够以剂量依赖性的方式抑制 HUVEC 细胞的增殖。抗 HER2 单抗[3]的活性测定通常选取 HER2阳性的乳腺癌细胞，如 BT474、SK-BR-3、SKOV3 等作为靶细胞，抗体与靶细胞表面 HER2 抗原结合后，能够有效抑制细胞生长信号传递，从而抑制细胞增殖。抗EGFR 靶点单抗[4]也是通过特异结合并封闭表皮生长因子受体，有效抑制肿瘤细胞生长，如 DiFi 细胞、A431细胞增殖抑制法等。 　　1. 2 细胞毒性法 　　细胞凋亡有两条途径，一是线粒体依赖途径，另一个为死亡受体介导途径。肿瘤坏死因子-alpha; （ tumornecrosis factor-alpha,TNF-alpha;） 和受体结合后，可启动死亡受体介导途径，使 procaspe-8 自我水解、活化，形成活性caspase-8,后者再激活 caspase3、6、7 等，引起下面的级联反应，导致细胞发生凋亡[5].重组人 II 型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的活性测定可以利用其能够抑制 TNF-alpha; 所引起的敏感细胞系 U-937 中 caspase 3/7 活化，通过 Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒中萤光素酶发光信号的改变来反映该制品的活性。此外，针对 TNF-alpha;的单抗还可以采用对 TNF-alpha; 杀伤敏感的细胞系，如小鼠成纤维细胞 L929、小鼠纤维肉瘤细胞 TT、MTS、CCK-8等在内的染料具有各自的优缺点。结晶紫是一种三苯甲烷类染料，常用作生物染色剂和无机离子的显色剂。 　　其染色过程虽然相对简单，但是不能区分死活细胞，只能反映细胞数量。而 MTT 作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水不溶性的橙黄色甲臜产物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因此可间接反映活细胞数量，但 MTT 还原产物不溶于水，需被溶解后才能检测。MTS 还原产物是水溶性的甲臜，无需洗涤和溶解步骤，使用更方便，重复性优于 MTT.而 CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，溶液相当稳定，对细胞没有毒性，可长时间孵育，是用于测定细胞毒性或细胞增殖试验中活细胞数目的一种简便快速、灵敏度高、重复性好的染料。 　　1. 3 补体依赖的细胞毒法 （ p