大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作.pdf

大肠杆菌O157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤 提前准备 从检测培养基上挑取单菌落，接种于含 5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂 （TSA-SB ）平板 （或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养 14-18 小时；用同 一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中的 TSA 、HIA 或相似培养基，以保证必 要时重复检测同一个克隆。同时接种标准株 H9812。 第一天 步骤 1 细菌的包埋 1、打开水浴摇床 （54℃）、水浴箱 （56℃）。 2、 用 TE 缓冲液 （具体试剂配制方法见附件）制备 1%Seakem Gold：1%SDS 琼脂 糖，以配制25ml 体积为例说明，方法如下： 1） 准确称取 0.25g SeaKem Gold agarose, 放入 250ml 的蓝色瓶内。 2） 加入 22.5ml TE 缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。 3） 微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热 30 秒，取出轻柔摇荡，再次 加热 30 秒，重复操作直至琼脂彻底溶解 （无颗粒物、悬浮物，透光均一，无 明显异常折光，无气泡）。 4） 将溶解的 SeaKem Gold agarose 放入 56℃ （55-60℃均可）水浴箱内至 少 15 分钟，再加入预热到 56℃的 10%SDS 溶液 2.5ml，置于 56℃水浴箱备用。 3、 在 Falcon 2054 管 （或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在 1.5ml 微量离心管上标记好对应样品的名称。 4、 在 Falcon 2054 管中分别加入约 2ml 细胞悬浊液 CSB （配制方法见附件）。 注：使用测定细菌浓度的容器不同加入 CSB 的量也不同。 5、 用 CSB 湿润棉签，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于 CSB 中。通过加入 CSB 稀释或增加菌液浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。 1） 用比浊仪 （bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度，并调整浓度至 4.0-4.5 麦氏单位。 2） 用分光光度计时，在 610nm 波长吸光度应在 1.3-1.4。 3）Dade Microscan Turbidity Meter：0.48-0.52 （以Falcon 2054 管测量） 0.68-0.72 （以Falcon 2057 管测量） 注：在 4.0~4.5 该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果，但过大的浓度 差距会造成同一块胶上的条带亮度差异，影响条带的识别。 6、 取 400µl 细菌悬浊液于相应的 1.5ml微量离心管中，置于 37℃水浴中孵育 5 分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。 7、 从水浴箱中取出微量离心管，每管加入 20µl 蛋白酶 K （储存液浓度 20mg/ml） 混匀，使其终浓度为 0.5mg/ml，蛋白酶 K 置于冰上备用。 注：蛋白酶 K 的终浓度是指在加入400µl 琼脂后的浓度。 8、 加入 400µl 的 1%Seakem Gold：1%SDS 到上述装有 400µl 细菌悬液的微量离 心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。（此时 1%Seakem Gold：1%SDS 需 置于 56℃水浴中） 注：没有用完的 Seakem Gold agarose 可放于室温，并可重复使用 1-2 次。再溶 时，加热时间缩短到每 10-15秒一次，直至完全溶解。 9、 迅速将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固 10-15 分钟。为节省 时间也可以在 4℃下凝固 5 分钟。 10、记录好模具内对应样品的名称。 步骤 2 细菌的裂解 1、 在 50ml 离心管上做好样品标记。 注：相同菌株的胶条可以同时放于同一个管中裂解，最多不要超过 4 条。 2、 配制细胞裂解液 CLB （配制方法见附件），然后向每 5ml 细胞裂解液加入 25µl 蛋白酶 K （20mg/ml），使其终浓度为 0.1mg/ml，然后颠倒混匀。 注：蛋白酶 K 要置于冰上，配制好的蛋白酶 K/CLB 混合液也要置于冰上。建议配 制总量后进行分装。 3、 每个离心管加入 5ml 蛋白酶 K/CLB 混合液。 4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。打开可重复利用 模具，用小铲将胶块推入上述裂解混合液中。保证胶块在液面下，而不在管壁上。 注：剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒。可重复利用模具需要浸于 泡腾片消毒液