人冠状动脉粥样硬化斑块内IL-6、IL-18、TNF-α、CD62P表达对斑块稳定性影响.pdfVIP

内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2008年) 收集内蒙古医学院病理中心1993年一2007年间尸检的人冠状动脉石蜡包埋组织 标本，共104例。其中76例是经病理诊断证实有冠状动脉粥样硬化，男64例，女12例， 肿瘤、感染性疾病；两组间性别(经x2检验)与年龄(经方差分析)无差异(P0．05)o 1．2主要试剂 (1)兔抗人IL一18多克隆抗体，浓缩型(武汉博士德生物工程有限公司生产，编号 BAl215)o (2)兔抗人曰岍一a多克隆抗体，浓缩型(武汉博士德生物工程有限公司生产，编号 BA0131)。 501101)。 编号MS—1746一so)o (5)即用型斌免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产，编号 (链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物)o 包括试剂A(内源性过氧化酶阻断剂)、试剂B(动物非免疫羊血清)、试剂C(生物素标记 的山羊抗小鼠或兔IgG)、试剂D(链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶)o (7)Ⅸ蝠试剂(武汉博士德生物工程有限公司生产，编号1022)o 1．3分组 1．3．1斑块形态观察 在光学显微镜下对常规m染色的冠状动脉组织切片进行观察，观察动脉内斑块形 态(偏心或同心)，斑块内脂核大小、有无出血坏死、纤维帽厚薄及炎性细胞、平滑肌细胞 多少，已备下一步继续分组o 1．3．2斑块形态测量 用Smartscape2002生物显微镜图像分析系统并参考文献(81对斑块面积、脂质核心 面积、纤维帽厚度进行测量。斑块面积为内弹性膜所包围的面积与管腔面积之差；脂核 面积为斑块内、纤维帽下由界限明显的白色淡染区域所构成，其内可见胆固醇结晶、泡沫 内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2008年) 细胞、炎性细胞及坏死物质。利用图像分析系统中多边形面积进行测量，用心表示。 纤维帽厚度测量选取覆盖于脂核之上纤维帽最厚处进行测量，利用图像分析系统中长度 测量工具进行测量，用舯表示o 1．3．3分组 通过光学显微镜观察，并结合Smansc印e生物显微镜图像分析系统对斑块面积、脂 质核心面积、纤维帽厚度的测量，参照文献[9、1们将冠状动脉石蜡组织块标本分为不稳定 斑块组、稳定斑块组和正常血管组。即脂质核心大，脂核面积占斑块面积的40％以上 肌细胞成分较少，此为不稳定斑块；脂质核心小，脂核面积占斑块面积的40％以下，纤维 帽厚大于65弘m，纤维帽内平滑肌细胞多而炎性细胞较少，此为稳定斑块；血管内膜腔面 光滑完整，主要由单层内皮细胞构成，其下为较薄的内皮下层，再下为内弹性膜，中膜主 要由平滑肌细胞构成，此为正常的冠状动脉血管。 1．4免疫组织化学检测 1．4．1IL—18、曰盯一a采用斌法 (1)4呻厚切片，置于经棚处理的载玻片上，90℃烤箱40分钟o (2)二甲苯脱蜡2次x10分钟。 (3)梯度酒精100％、95％、80％，每次5分钟。 (4)3％H2q室温孵育10分钟，以清除内源性过氧化物酶。 (5)蒸馏水冲洗x3次o (6)微波抗原修复，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(PH6．O)的容器中，微波炉内加 热使液体沸腾持续20分钟，间隔5—10分钟，重复一次，取出，室温下冷却(不可将切片 从缓冲液中取出冷却)。根据抗体说明书上要求曰岍一a不用作抗原修复o (7)PBS工作液(肿．4)冲洗5分钟x3次o (8)5％的正常山羊血清封闭(试剂盒中5％峪)，室温孵育15分钟。 4℃冰箱过夜。 3次o (10)PBS工作液冲洗5分钟x 钟o (12)PBs工作液冲洗5分钟】【3次o 囱鏊直匿堂堕巫主堑壅生堂垡迨塞(塑墨堡2 (13)滴加链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物，37℃恒温箱孵育20分钟o 3次o (14)PBS工作液冲洗5分钟x (15)Ⅸ疆显色剂显色(镜下控制)10—15分钟，自来水冲洗终止显色o (16)苏木素复染，自来水冲洗，人1％盐酸乙醇分化20秒，自来水冲洗5分钟返蓝， 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片o 1．4．2 IL一6、CD62P采用sP法 (1)、(2)