大鼠雪旺细胞原代培养及川芎嗪对其增殖的影响.pdfVIP

硕士学位论文 第一章前言 嗪能够维持细胞生物膜的完整性减少缺血对线粒体的损害“”。并能使细胞内c—AMP 水平增加，降低Ca”浓度“…。宋德明“”等发现川芎嗪能抑制成纤维细胞的胶原合成与 细胞增殖，并认为这些效应的产生机制与』】』芎嗪的钙离子拮抗作用有关。而且c—AMP 水平升高对于雪旺细胞的增殖有促进作用n“。 体外培养雪旺细胞需要使用胰蛋白酶、胶原酶等消化神经组织，川芎嗪的维持 细胞生物膜完整性的作用可能对离体的雪旺细胞有保护作用。川芎嗪的升高c—AMP 水平的作用，对雪旺细胞的增殖可能有促进作用。而且体外培养雪旺细胞最主要的 杂质细胞就是成纤维细胞，川芎嗪对成纤维细胞胶原合成与细胞增殖有抑制作用。 综合这些原因，我们设计本实验来了解川芎嗪对体外培养的雪旺细胞是否有促进作 用，以为进一步开展细胞移植治疗脊髓损伤的研究打下基础。 硕：E学位论文 第二章材料和方法 第二章材料和方法 2．1组织来源 后用D-hanks’液冲洗3遍。手术显微镜下，于股骨干后外侧切取双侧坐骨神经。并 在16倍手术显微镜下仔细分离剥除神经外膜，分离成神经束，在D-hanks’中漂洗 后剪碎。 2 2主要仪器及器材 Scientific公司)， 37。C体积分数5％C0。培养箱(Foma HSZ—H恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子技术公司)， I，IIs一3C型酸度计(上海雷磁仪器厂‘)， 川S7fRAC一100离心机(英国MSE公司)， BCM一100型生物洁净工作台(苏净集团安泰公司)， 25cm!一次性塑料培养瓶、培养板(丹麦Nunc公司)。 倒置相差显微镜(日本Olympus公司) Zeiss公司) 手术显微镜(Carl 2．3主要试剂及配剂 2．3．1主要试剂 I型胶原酶、胎牛血清、G一418(GIBCO公司)， 胰蛋白酶、DMEM培养液、D．hanks’液(Sigma公司) 青霉素、链霉素、分析纯NaHC03、NaOH、HCI购自长沙丽欣公司 盐酸川芎嗪粉剂(北京四环科宝制药有限公司) L一多聚赖氨酸(相对分子质量为15Yj-～30万，Sigma公司) 硕士学位论文 第二章材料平¨方法 兔抗鼠S一100蛋白酶联免疫细胞化学试剂盒(武汉博士德公司) NGF冻干粉剂(厦门北大之路生物工程有限公司) 2．3．2主要配剂 DMEM高糖培养液：含4．Ommol／LL-谷胺酰胺，4．5mg／L葡萄糖的DMEM，加 青、链霉素各IOOU／mL的培养液。 u 纯化培养液：含100g／mLG-418的上述DMEM培养液。 消化酶：质量浓度0．25％胰蛋白酶及O．2％I型胶原酶的D-hanks’液。 含2％、8％、16％川芎嗪的DMEM高糖培养液。 ·7H：0：2．169／L(高压灭菌)． 2．4细胞培养纯化及免疫组化染色鉴定 2．4．1细胞培养及纯化 取已经剪碎的神经组织，加入3mL质量浓度为O．25％的胰蛋白酶及lmL质量浓 度为O．2％的I型胶原酶在37℃培养箱中混合消化30min。吸弃上清，加入0．2％的 I型胶原酶4mL，37℃消化60min，消化过程中每隔20min振荡消化液以利于消化。 消化结束和肉眼可见坐骨神经碎片多成混悬状，仅余有少量肉眼可辨的组织，用无 菌100目滤网过滤去除之。 将过滤后混合液以1000r／min离心5min，吸弃消化液，加入含体积分数20％胎 含体积分数20％胎牛血清的DMEM高糖培养液，吹打混匀。计数后调整细胞浓度为l ×10；个细胞／mL的细胞接种于培养瓶中，置于体积分数为5％的C02培养箱中37。C培 养。 u O-418的纯化培养 在细胞种植后的第4天，吸净原培养液，加入含100g／mL 液继续培养4天后更换DMEM高糖培养液。期间随时使用倒