第2章 反相层析.pdfVIP

根据溶质的性质根据溶质的性质，，采用采用极性的流极性的流 动相动相和和非极性的固定相非极性的固定相的分离体系的分离体系， 利用固定相非极性基团的疏水效应 而建而建立的的一种分离模式种分离模式。 反相层析介质的表面通常比疏水层析介质更加 疏水疏水。这导致更强的相互作用这导致更强的相互作用，以至于为了成功的以至于为了成功的 洗脱，需要用非极性的有机溶剂比如乙腈或甲醇。 疏水相互作用层析则提供了利用生物分子疏水性的 另另一种方法种方法，，即通过在更极性的即通过在更极性的，，变性能力更弱的变性能力更弱的 环境下工作。 反相层析具有极高的分辨率，可以分离只具 有微弱疏水性差异的组分有微弱疏水性差异的组分。。 RPRP-HPLCHPLC separatesseparates rabbitrabbit andand humanhuman insulininsulin thatthat differdiffer byby only a single amino acid. Column:Column: VYDACVYDAC®214TP54214TP54 Eluent: 27–30% acetonitrile (ACN) in 0.1% TFA over 25 minutes at 1.5 mL/minute. 反相‐高效液相色谱法柱和多肽之间的作用机理 多肽与反相吸附剂之间互动 的吸附的吸附//解吸吸模型解吸吸模型 多肽通过流动 相相进入反相柱进入反相柱 多肽被吸附到反 相吸附剂的表面 随着有机相浓度的随着有机相浓度的改变并改变并 达到临界值时多肽从反相 吸附剂表面解吸 多肽通过流动相进入反相柱。多肽的疏水性部分（又称 作疏水“脚”）被吸附到反相材料的疏水性表面，直到 随着有机相浓度的改变并达到临界值时多肽才从反相吸 附剂表面解吸附剂表面解吸 “反相相”一词词是从“常相常相”衍生衍生出来的的。常常 相层析是相层析是一种使用亲水固定相和含有己烷或氯甲烷种使用亲水固定相和含有己烷或氯甲烷 等有机溶剂作为流动相的技术。在反相层析中，固 定相是疏水的，所以使用了水/有机溶剂作为流动 相使用相使用，就是说就是说，固定相比流动相更加疏水固定相比流动相更加疏水。反相反相 层析填料作为吸附体而洗脱溶液作为流动相。  REVERSED PHASE： NORMAL PHASE： 载体：球形微粒多孔硅胶、特殊的高分子合成 材料。 特点：机械强度高； 具有较多的可用于活化的羟基； 微孔结构容易控制。 配基配基：：烷基化合物烷基化合物，如如C4C4、、C8C8、、C12C12、、C18C18等等。。 碳链越长，疏水性越大，稳定性越好。 碳链长碳链长，所占空间体积较大所占空间体积较大，介质表面可使用的介质表面可使用的 有效孔径变小，柱效下降。 生物大分子：C4、 C8C8的烷基的烷基；； 多肽多肽：C18C18烷基烷基 Peptide separation on different reversed-phase columns Columns: VYDAC®218TP54 (C18); 214TP54 (C4); 219TP54 ((phenyl)); Eluent: 15–30 % ACN in 0.1% aqueous TFA over 30 minutes at 1.0mL/min. Sample: 1.oxytocin, 2.brad