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酵母双杂交 — 研究蛋白质与蛋白质的相互作用 酵母单杂交 — 研究蛋白质与特定DNA序列之间的相互作用 酵母双杂交 — 研究蛋白质与蛋白质的相互作用 酵母双杂交 为什么要蛋白质与蛋白质之间的相互作用？ 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。 几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制 与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢 等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 酵母双杂交系统简介 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵 母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究 活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作 用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技 术。该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间 的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之 间的相互作用。 酵母双杂交的基本原理 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录 起始过程的认识。真核生物基因转录需要转录激活因子 的参与，真核生物转录因子含有两个不同的结构域： DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活因子 转录激活结构域(AD) (activation domain) 酵母双杂交的基本原理 这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没 有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接 建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基 因表达的激活因子的功能。 BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所 调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它 所调节的基因的转录。单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能 激活转录。 酵母双杂交的基本原理 Gal4为酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子，天然的Gal4 分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。 两个结构域中的DNA-BD 由位于N-末端的1～147位多肽构 成，能识别位于Gal4效应基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS) 。 此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD 由位于C-末端 的768～881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上 充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性，激活UAS下游 启动子，使启动子下游基因得到转录。 酵母双杂交的基本原理 Fields和Song建立的双杂交系统，是将两个融合蛋白分 别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋 白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4 是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。 酵母双杂交的基本原理 当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基 因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用， Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的复合物 Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD 。 Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并 可与之结合； Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活 UAS下游报告基因LacZ 的转录。 酵母双杂交的基本原理 酵母转录因子（Gal