玻璃体注射曲安奈德对视网膜裂孔光凝后愈合地影响地实验的研究.pdfVIP

复邑大学碗十学位论文 材料与方法 TGF一13 2二级抗体(KangChen，1：5000) GAPDH(KangChen，1：10000) GAPDH二级抗体(Kan【gChen．1：5000) 2．主要仪器 供) 激光共聚焦显微镜：TCSSP2 LEICA(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院中心实验室 提供) 透射电子显微镜：PHILIPSCMl20(复旦大学上海医学院电镜室提供) 氩532倍频激光机：BVI(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院手术室提供) 手术显微镜：zEISS(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院中澳合作实验室提供) 匀浆器(上向康华生化仪器) 低温离心机(上海安亭科学医学仪器厂) 酶标仪(Thermo) 电泳仪(北京六一仪器厂) 电泳、转移装置(BIO．RAD) 磁力搅拌器(太仓华美生化仪器厂) 脱色摇床(兴化化仪器厂) 反应容器(上海康成生物有限公司) 3．实验动物 成年健康青紫蓝兔9只，清洁级，体重均为2．3．2．6kg，雌雄不限，动物的使 用、保护和处理遵循ARVO关于实验动物使用、保护和处理的有关声明。 二． 实验方法 1．气性玻璃体切割 兔结膜囊滴入表面麻醉眼药水，并用无痛碘消毒，在角膜缘后2mm处用lml 针筒缓慢注入约0．5mlC3F8，并同时用另一枚lmi针头进行前房穿刺以降低眼压， 双眼操作后局部用降眼压药、抗炎药、扩瞳药，观察一周。以上过程均由同一术 者完成。 2．分组，制造视网膜裂孔，激光光凝，分别玻璃体注入曲安奈德或对照液 将一共9只实验兔的左眼作为实验干预组，右眼作为空白对照组。按每公斤 体重1-2mg盐酸氯胺酮肌肉注射将兔麻醉，使用美多丽、倍诺喜散疃表麻，无痛 碘消毒，铺洞巾，开睑，在角膜缘后约2mm处穿刺刀穿刺，经穿刺口伸入眼内 激光头，在手术显微镜直视下，在双眼视乳头下方左右两侧分别轻触视网膜以制 造直径约1．5PD的视网膜裂孔各一枚，随即用氩532倍频激光在裂孔周围光凝， 6 复旦大学硕上学位论文 材料与方法 能量为80mW，曝光时间0．3s，每个裂孔周围均约打150点激光，光凝斑在手术 显微镜直视下均呈二级光凝反应，光凝斑直径约200微米，术毕分别向左眼玻璃 体腔内注入4mg／0．1ml曲安奈德，向右眼玻璃体腔内注入O．1ml平衡液以代替曲 安奈德，接着缝合穿刺口，局部滴用抗炎扩瞳眼药水。以上过程均由同一术者完 成。术后每日为兔滴用抗炎扩瞳眼药水。 3．组织学检查取材 为了观察视网膜裂孔周围光凝斑反应的组织学改变，在光凝后2周处死实验 兔，方法是往兔耳缘静脉注入空气。处死后立即取出眼球，左右眼分别置入光镜 或电镜固定液中，固定48小时。 4．光镜检查 用于光镜检查的标本，再经梯度酒精系列脱水、石蜡包埋后切片，约铋m厚 度，用二甲苯脱蜡，常规HE染色，光镜观察并用光学照相显微镜摄片。 5．电镜检查 用于透射电镜检查的标本，再用1％四氧化锇后固定，系列浓度的乙醇逐级脱 水，环氧丙烷置换两次，浸透，环氧树脂618包埋，半薄切片定位后，做超 薄切片，置于透射电镜下观察并摄片。 6．Western Blot免疫印迹法 (1)取材 按上法处死4只实验兔后(每组各8个裂孔)，立即取出双眼球，去除眼 球前节，在显微镜下找到实验性视网膜裂孔及周围激光斑，用显微镊子剥 下局部网膜组织，即刻置于冷冻管并投入液氮容器内，待取下所有标本后， 将冷冻管转移至一80度冰箱内以备下一步操作 (2)蛋白质抽提 A． 组织称重，切小块放入管中。 B． 配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1ml抽提试剂中加入轨l蛋白酶 抑制剂混合液，却IPMSF和靴l磷酸酶混合液)。 C． 加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(250mg组织中加入lml抽 提试剂)。 D． 用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织 完全裂解。 E． 裂解液于预冷的离心机中14，000转／分离心15分钟。上清液立刻