丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶A在胃癌中表达及其及胃癌患者预后关系.pdfVIP

染后24h荧光显微镜观察细胞的转染效率；48h倒置显微镜观察细胞形态的变化。 (二)干扰载体对LDH．A在胃癌细胞中表达的影响 采用Western blot半定量检测方法从蛋白水平检测转染后siRNA对LDH—A的 抑制效果。 (三)干扰载体(干扰LDH_A的表达)对胃癌细胞增殖及侵袭的 影响 观察重组质粒对细胞生长增殖的影响。 2、采用划痕法Wound healingassay细胞迁移实验检测转染pGPU6．GFP． siLDH．A重组质粒的人胃癌细胞BGC．823迁移能力的改变。 质粒的人胃癌细胞BGC．823侵袭能力的改变。 结果 免疫组化染色显示PDH蛋白定位于细胞浆，在胃癌原发灶中的表达阳性率为 淋巴结转移，淋巴管浸润，组织学类型和TNM分期有关(P0．05)。生存分析 显优于低表达者(PO．001)。多因素分析(校正协变量包括年龄、Lauren分型、 TNM分期、淋巴结转移、病理类型、肿瘤大小、肿瘤的侵袭深度和淋巴管浸润) ratio=0．608，95％C1 显示PDH的表达在胃癌是一个独立预后因素(Hazard 0．504-0．734，P0．001)。 免疫组化显示LDH．A蛋白定位于细胞浆，在胃癌原发灶中的表达阳性率为 在弥散型胃癌和未分化胃痛中，高表达LDH．A胃癌患者预后明显低于低表达者 (P0．001)，而肠型胃癌及分化型胃癌中生存曲线未见上述趋势。多因素分析(校 3 正因素包括年龄、Lauren分型、TNM分期、淋巴结转移、病理类型、肿瘤大小、 肿瘤的侵袭深度和淋巴管浸润)显示LDH．A在胃癌的表达是一个独立危险因素 ratio=1．829，95％CI (Hazard blot检测了正 1．375．2．4330，P0．001)。利用Westem 中LDH．A表达不显著。DNA测序证实成功构建了针对LDH—A基因的三条小干扰 重组质粒作用 RNA重组质粒载体包括pGPU6．GFP．siLDH．A(980，506，376)； BGC．823细胞48h后，形态学可见野生组BGC．823，细胞贴壁生长旺盛，边界清楚， 态发生明显改变，细胞贴壁能力下降、密度降低、细胞变变圆、小、颗粒增多、 碎片增加、并有脂滴形成。对照组细胞与野生型细胞形态上未见明显差别。转染 效率约为40．60％。Westernblot检测结果显示所构建的重组质粒载体对人胃癌 BGC．823细胞的增殖均具有明显的抑制效应，从转染后24h开始细胞增殖受到抑 制，48时细胞增殖受抑制极为明显(p0．01)；划痕法Woundhealingassay细胞迁移 人胃癌细胞BGC．823，发现侵袭能力比未转染细胞减弱。 结论 为了评价PDH表达的临床意义，我们采用大批量胃癌组织标本进行免疫组化 染色，结果在256例患者胃癌组织中PDH表达有差异。尽管机制尚不清楚，却有 足够的理由推断PDH作为一个能量代谢链上的一个至关重要的酶，其低表达可能 与肿瘤的侵袭发展有关。此外，PDH表达也可以作为一个独立预后因素，其降低 表达与较差的预后相关。 LDH．A在胃癌组织中显著高表达，与癌组织周围正常黏膜组织有著差异。 PDH蛋白表达升高与患者较高年龄和较低的组织学分化程度相关，而与其它临床 4 病理特征如劳伦斯分型、淋巴结转移、淋巴管浸润、淋巴结转移、疾病分期无关。 生存分析表明LDH．A高表达与胃癌患者的不良预后明显相关。本实验成功构建了 LDH．A的shRNA真核表达质粒载体，并在脂质体的介导下分别转染人胃癌细胞 blot、MTT、细胞迁移实验 株BGC．823(LDH．A基因高表达细胞株)，采用Western 等技术，