荧光定量pcr技术20101.10生物科学-分子生物学.pptVIP

溶解曲线检测引物特异性 Melt curve showing two amplified products 1、引物、探针的设计原则： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段200 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的设定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃， 30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同 荧光定量PCR的解析方法（依据课题要求提前确定） 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 荧光定量PCR仪的硬件条件 TIANGEN公司荧光定量产品 样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。 如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA 使用比较CT法的优点就是可以不需要标准曲线。也可以排除在创造标准曲线时因为稀释误差而引起得副作用。只要目的基因及参照物有着类似得动态范围，则比较CT值法是最有效的方法。我们希望校正物比目的基因有较高得表达水平（较低的CT值），定量得计算就是获得目的基因和校正物间的CT值差别（⊿Ct）开始得。 ⊿Ct＝Ct(目的基因)－Ct（校正物） 对每一个要被定量的样品，这个值都被计算（如果目的基因值比校正物值高，则是正值，而如果是个负值也是可以得）应该选择一个样品作为参照（基线），这样其他样品都与其相比较。相比较的⊿⊿Ct包括了每个样品间⊿Ct值的差异，及与基线相比较的差值。如果基线代表了最小的表达水平，则⊿⊿Ct应该是负值，因为基线样品的⊿Ct是最大的，因为它有最大的CT值。如果有些样品的表达水平是升高，而另一些下降，则⊿⊿Ct是个负值和正值得混合。定量的最后一步就是将这些值转换成绝对量，相对表达量的公式是2-⊿⊿Ct 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ） 扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。 由于DAN/RNA量不同，基因表达的定量分析都要与一个初始参照基因想比较。对于RNA的量 ，由于组织，细胞数目，试验步骤，或RNA抽提效率的不同，会有很大的波动 这里还有一些经常被使用的看家基因：beta-actin, GAPDH， cyclophilin,18sr RNA ,phosphoglyserokinase,beta-microglobulin,beta-glucronidase,hypoxanthine ribosyl transferase,transferring receptor 及另外一些。要注意看家基因可以被反应调节所影响 ，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必须得。 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进